微流控技术在病原微生物检测中的研究进展

摘 要 ： 快速、准确地检测病原微生物对于疫情防控和保障人民生命健康具有重大意义。近几年，研究者们通过合理地设计微流控芯片，将微流控技术与各种检测技术相结合，已经开发出了多种用于病原微生物检测的技术方法。相较于传统的病原微生物检测技术，微流控检测技术优势突出，具有操作人员技术要求不高、样本需求量少和自动化程度高等优点，适用于各种复杂环境下病原微生物的精准、快速检测。本文对微流控技术在病毒、细菌、真菌、衣原体及支原体等病原微生物的检测应用进行了综述，以期为病原微生物的检测提供研究思路，促进微流控技术在病原微生物检测中的发展，提高对疾病的预防和控制能力。

病原微生物是指能够引起人类或动物疾病的微生物，包括病毒、细菌、真菌、衣原体和支原体等。病原微生物可以通过空气、体液等介质传播，危害人体健康，造成财产损失。因此，对病原微生物快速、准确以及灵敏的检测是降低其危害的重要手段。传统的病原微生物检测方法包括染色、培养、生化鉴定等方法，存在耗时长、成本高、操作复杂等缺点。微流控技术的出现为病原微生物的低成本、高通量、高效率检测提供了新的研究思路和方法。本文基于微流控技术在不同病原微生物检测中的研究进展作一综述，旨在为微流控技术在病原微生物检测中的研究提供参考，进而推动微流控技术在病原微生物检测中的应用。

1 微流控概述及其分类

1.1 微流控的简介

微流控（microfluidics）指的是使用微管道（尺寸为数十到数百微米）处理或操纵微小流体（体积为纳升到阿升）的系统所涉及的科学和技术。微流控系统通常包含阀门、微通道、反应室、压力系统和检测系统，通过控制微流控装置内流体的运动来实现样品制备、反应、分离和检测等功能。微流控技术能够控制微小流体，整合多种反应，其在病原微生物检测中可以在微观水平上精确控制样品体积并减少体内和体外环境之间的差异，进而达到缩短反应时间和降低检测成本的目的，具有快速、准确、样品消耗少等优点，为病原微生物的检测提供了广阔的前景。微流控技术在病原微生物检测中的应用如图 1。

图 1 微流控在病原微生物检测中应用

1.2 微流控技术的分类

微流控技术发展迅速，种类众多，应用十分广泛，对于微流控技术种类的划分还没有统一的标准。基于微流控芯片的驱动方式可将其分为主动型微流控和自驱型微流控。主动型微流控一般利用的是外源性驱动力进行微流体的操控，主要包括压力型微流控、离心型微流控、磁力型微流控、数字化微流控等。各类型微流控特点如下 ：（1）压力型微流控 ：利用气体压力或液压或气液压混合，来控制液体在芯片中的运动；（2）离心型微流控：一般为对称盘式构型，利用旋转产生的离心力来驱动液体在芯片中的运动；（3）磁力型微流控 ：利用磁场来控制流体中的磁性物质，以驱动流体的运动 ；（4）数字化微流控 ：基于微升至纳升范围内的液滴精准操作，来实现复杂的实验室分析的独立平台，其微滴由液体表面张力特性形成。上述是常见的几种微流体驱动方式，研究人员通常将多种驱动方式组合来实现特定的目标功能。

自驱型微流控通常利用表面亲疏水特性或毛细力来进行流体的输运与处理，具有自驱动、无需外接动能、操作方便和容易控制等特点。其原理是基于纸质材料的易塑形、多孔、亲水、毛细管作用等特性进行物理或化学加工后构建出的平面（2D）或立体（3D）的纸基微流道，该微流道集样品前处理、分离、分析等功能于一体，可实现微量样本的快速检测。目前文献所报道的微流控装置多是外源驱动型微流控，而高通量、低能耗或无需外源驱动的微流控检测技术是未来主要发展趋势。

2 微流控技术在病原微生物检测中的应用

2.1 微流控技术检测病毒

基于微流控技术的病毒检测方法主要针对病毒细胞数量、表面特异性蛋白和特异性核酸片段来开展检测。基于病毒细胞培养的空斑测定法是病毒鉴定和诊断的金标准，但存在通量低、所需样品量大等问题，因此 Su 等设计了可以同时培养 5种病毒的聚二甲硅氧烷芯片，该芯片系统不仅实现了病毒的高效鉴定，还完成了病毒的分离和抗病毒药物的筛选，具有通量高和检测样本量少的优点。

微流控芯片培养法解决了传统培养法存在的一些问题，但仍存在培养周期长等限制，所以需要开发耗时少、精确度高的检测方法。而靶向病毒表面特异蛋白的微流控技术可以很好地解决目前培养法存在的问题，因而，Saraf 等基于适体和适体功能化的金纳米粒子与目标蛋白形成三明治夹心结构，然后和银试剂反应获得比色信号，设计了对寨卡病毒和基孔肯雅病毒等病毒包膜蛋白进行多重检测的微流控检测芯片，该芯片系统在 2 h 内完成了对磷化氢缓冲盐水和小牛血中寨卡病毒和基孔肯雅病毒的高特异性检测。为了在微流控检测系统中实现对多靶标蛋白的灵敏识别，Guan 等设计了一个集成两种单克隆抗体（mAb）的微流体系统，用于肠道病毒 71（EV71）的灵敏检测。该系统将 EV71 的主要衣壳蛋白 VP1 的单克隆抗体 1F4 和 2H2 分别与羧基官能化磁珠和羧基官能化量子点偶联，最后通过荧光强度来直接评估靶标蛋白的浓度。该微流体系统在 30 min 内对 VP1 的检测限（LOD）达到 10pg/mL，与使用相同抗体的夹心酶联免疫吸附试验的结果（310 pg/mL）相比，提升了 31 倍。

随着技术的不断完善与发展，基于病毒表面特异蛋白的微流控技术在耗时、特异性以及灵敏度等方面均有很大的提升，但是面对低丰度、高感染性的病毒靶标时，仍存在灵敏度不够的问题，而以精确度高著称的核酸检测法可以弥补蛋白检测法存在的缺陷。基于此，Tian 等开发了一种检测病毒特异性核酸序列的全自动离心微流控系统（图2‑a），所有检测流程被整合到封闭的自动化微流体系统之中，当口咽拭子样品被注入微流控盘后，该系统自动进行样品处理、反转录环介导等温扩增、荧光信号检测等检测流程，其在 70 min 内完成了对 21 个样本的高灵敏检测，最低检测限达到 0.5copies/μL。而当面对致病率极高的病毒时，快速且高效地筛查出阳性患者是有效开展防疫工作的保障，因此，Li 等基于一个独立的微流控系统开发了一种简单、灵敏和无需仪器的病毒检测系统（图 2‑b）。

图 2 病毒检测微流控系统

该系统将等温扩增、CRISPR 技术和侧向流动检测集成在一个封闭的微流体芯片中，当 RNA 病毒样本加入到微流控芯片后，通过侧向流动试纸，肉眼即可直接观测检测结果。这种操作简单、灵敏度高、成本低的微流控系统有望被推广应用到大规模的病毒筛查检测中。

目前常见的微流控系统通常需要外源驱动，所以动力供应会限制微流控技术的应用和发展。基于此，Yao 等设计了一种自供电快速加载微流控芯片（图 2‑c），可同时检测裂谷热病毒、基孔肯亚病毒和登革热病毒 I、II、III 和 IV 亚型等 8 种病毒，无需外源驱动，50 min 内即可完成检测，灵敏度可达 50-100 copies/μL。Kim 等研究发现具有毛细作用力的纸基微流控在无外源驱动条件下即可实现对病毒的捕获和检测，利用其独有的特性开发了一种手持式纸基微流控系统，可直接捕获空气中的液滴进行检测。通过在空气中喷洒含有病毒的人类唾液样本来模拟自然环境，验证发现该系统从捕获病毒到智能手机完成数据分析总耗时 30 min。这项技术为提高微流控系统的病毒检测效率提供了新思路。

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