微流控技术开发合成聚两性溶解液纳米凝胶胶体的新型分步方法

生命系统的一个迷人特征是它们能够使用在纳米尺度上表现出功能的分子结构，并通过水介质中的自组织和区室化将它们转化为更复杂的实体。在自然界中，信息由多个连续的组织层次存储，甚至生命的起源似乎也与分子结构和能量载体的区隔化有关.因此，了解这些原理将有助于开发用于催化，机器人和医学的新型生物启发可持续材料.通过设计具有空间不同组件的系统，可以将多种功能组合在一起，而不会相互失活和失去效果.这可能对新药物载体的概念特别感兴趣。为了在药物治疗中有效使用，必须保护药物分子免受恶劣环境条件的影响，例如强烈的pH值变化。活性物质只能在病变部位附近释放，以减少不良副作用并降低成本.各种胶体结构（例如囊泡、脂质体、胶束）已经被认为是药物的载体.刺激反应性微凝胶是靶向药物递送的有希望的候选者，因为它们的内部结构可以被分隔，有效载荷的释放可以由环境触发器刺激。

微凝胶是三维交联聚合物的微尺度网络，与其他（大分子）材料不同，因为它们表现出硬纳米颗粒和软大分子的二元特性。一旦在溶剂中膨胀，微凝胶就含有大量的溶剂分子，因为它们具有开放和多孔的网络结构.当微凝胶网络的化学成分被调整时，可以引入对刺激的敏感性，例如温度，pH值，离子强度，光，或超声波。环境的这种变化会引发微凝胶的膨胀或塌陷。响应性微凝胶的突出例子是基于聚（N-异丙基丙烯酰胺）（PNIPAAm）的胶体水凝胶，由于其温度响应性和低细胞毒性而被广泛研究。由于线性PNIPAAm链具有较低的临界溶液温度（LCST），它们的交联网络在生理温度>32°C.12a）下发生体积-相变（VPT）。

除了经历VPT外，PNIPAAm网络还可以对pH值敏感，因此，当掺入弱酸性或碱性共聚单体时，具有多反应性，这些可电离的微凝胶可用于运输带电的客体分子，因为它们允许通过静电相互作用有针对性地吸收和释放所述分子.由于药理学中丰富的带电生物分子，pH响应性微凝胶是治疗药物递送的有前途的候选者。

然而，较大的生物分子，如DNA或蛋白质，组装成3D结构，不符合通过传统聚合方法合成的微凝胶的尺寸限制，如沉淀聚合或反向微乳液聚合.此外，复杂的疾病需要递送多种电荷或亲水性不同的药物，或者必须连续释放.

为了克服这些挑战，Peppas等人从含有聚阳离子2-（二乙氨基）乙基甲基丙烯酸酯基纳米凝胶的聚（甲基丙烯酸-co-N-乙烯基-2-吡咯烷酮）（P（MAAc-NVP））合成了水凝胶薄膜。干燥的水凝胶薄膜被机械粉碎和筛分以产生微凝胶<75 μm.他们表明，当使用酶不稳定交联剂时，阴离子微凝胶网络可以选择性地及时被胰蛋白酶降解，释放纳米凝胶，这反过来又诱导内吞作用并促进其货物的内体逃逸.这种方法的一个主要缺点是样品在大小和形状方面的异质性，这会影响实验的可重复性。

通过在微流控水滴中制备微凝胶，可以在10-1000μm的范围内精确调节其尺寸，并且可以精确控制内部和外部形态.在这里，通过掺入瞬时带电荷的单体部分形成聚电解质或聚两性质微凝胶也已得到充分证实，并且已被证明允许封装营养分子或模型药物.此外， Weitz等人通过将不同的材料（包括量子点、磁性纳米颗粒和聚合物微粒）嵌入微凝胶网络，为微凝胶引入了新的功能。即使在插入添加剂后，原始PNIPAAm网络的温度响应性仍得以保留.Santos等人将埃洛石纳米管整合到基于羟丙基甲基纤维素醋酸琥珀酸酯的微凝胶网络中。他们证明，该系统可以同时使用两种模型药物（阿托伐他汀和塞来昔布），它们的物理化学性质不同，但当组合在一起时，可以有效地对抗结肠癌。聚合物网络在酸性介质中稳定，但溶解在中性至碱性环境中，有助于快速和有针对性地释放共载药物.类似地，制造了类似Janus的微凝胶。为此，将阳离子温度响应纳米凝胶与聚丙烯酸、丙烯酰胺单体、交联剂和引发剂混合在水滴中。阳离子纳米凝胶和阴离子聚合物之间的温度和静电相互作用的升高迫使相分离，通过立即聚合得以保存。最近，Isa小组提出了用于多药物递送的超胶囊。他们采用微流体交叉结形成含有葡聚糖基纳米凝胶的油滴，当溶剂蒸发时，这些纳米凝胶会自发组装成超颗粒。该小组表明，负责将纳米隔室保持在一起的范德华力可以被超声波形式的高能输入打破，导致超粒子再次分离成奇异的实体.虽然这些分隔的超胶囊允许运输和释放多种药物有效载荷，但整合表现出相反物理化学性质或电荷的货物仍然具有挑战性。

以前的工作集中在将带电或疏水物质嵌入阴离子亲水网络中.然而，两种带相反电荷的聚电解质纳米凝胶物种的整合可能为正交药物递送开辟了途径。在这项工作中，我们首次展示了通过乳液滴中聚电解质纳米凝胶（NG）的耗尽絮凝和共凝聚来合成区室化的聚两性质微凝胶（MG）。为了清晰和可读性，我们在此使用术语“纳米凝胶”来表示通过沉淀聚合制备的聚合物凝胶，即使它们的直径（在HPLC级水中约为400-500nm）超过了IUPAC定义的纳米凝胶的尺寸范围。不同的名称应该有助于区分聚合物网络，因为微流体产生的微凝胶的尺寸要大几个数量级。在基于液滴的微流控装置中，通过常规沉淀聚合合成的带相反电荷的NG分散体被整合到水性乳液液滴中，然后聚合并交联N-异丙基丙烯酰胺。检查了微凝胶胶体中纳米凝胶 （NiM−C） 的宏观响应性，包括 pH 值、离子强度和温度，验证了 NiM−C 与纯 PNIPAAm MG 的反应相似。通过用荧光标签标记NG，我们使用共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）分析了NiM−C内NG的排列。我们发现，当NG凝聚并积聚在MG网络的一侧时，Janus样结构就会形成。我们提出了一个合理的案例，即这种凝聚机制的驱动因素是两种NG物质之间的静电相互作用以及聚合物链形成产生的消耗力。我们表明，由于带电NG的响应特性，它们可以通过调整合成条件（即NG浓度，离子强度和pH值）来调节它们在MG中的排列。

我们的目标是开发一种稳健的合成方法，以获得微米级的凝胶，这些凝胶在生理条件下含有带正电荷和带负电荷的隔室，以实现有效的药物封装。我们选择了基于PNIPAAm的网络与N，N′-亚甲基双（丙烯酰胺）（BIS）交联作为模型系统，因为NIPAAm是应用最广泛的单体之一，并且表现出接近人体温度的温度诱导VPTa，弱酸性甲基丙烯酸（MAAc，pKA≈5.032）和弱碱性N-（3-氨丙基）甲基丙烯酰胺作为pH响应性共聚单体被引入，因为它们是水溶性的，并且在中性pH值下带相反电荷。通过沉淀聚合合成了流体动力学直径为400–500 nm、共聚单体含量为10 mol%的聚电解质NG。如文献所述，必须仔细调整a合成条件，以提供所需的相应可电离共聚单体的掺入。对于含有APMH（pNG）的NG的合成，将pH值调整为碱性值，以确保共聚单体的去质子化。正如离子单体在水溶液中的自由基聚合所表明的那样，反应动力学受到生长的聚合物与反离子、其他聚合物主链或自由基物种之间的静电相互作用的负面影响。用阳离子偶氮引发剂2,2′-偶氮双-引发批量沉淀聚合。在含有MAAc（nNG）的NG的合成中，与NIPAAm相比，MAAc的消耗速度更快，这是通过将共聚单体延迟添加到酸性反应混合物中来解释的。以2,2′-偶氮双[N-（2-羧乙基）-2-甲基丙脒]四水合物（ACMA，VA-057）为引发剂，加入阴离子十二烷基硫酸钠（SDS）作为表面活性剂，得到与pNG相当的nNG尺寸。为了在视觉上和CLSM中有效地区分NG物种，通过在聚合混合物中加入丙烯酰氧乙基硫代氨基甲酰罗丹明B（Rhod B Ac）来标记nNG。通过将 NHS 酯与 NG 网络中的伯胺偶联，在修饰后反应中用花青 5 N-羟基琥珀酰亚胺酯 （Cy5 NHS） 标记 pNG。通过自动切向流渗滤（TFF）纯化后，通过扫描透射电子显微镜（STEM，图S2）、动态光散射（DLS，图S3）和电泳光散射（ELS，图S4）研究了NG的大小和温度、pH值和离子强度响应度。结果表明，在室温下，nNG在HPLC级水中的流体动力学直径约为400 nm，而pNG在相同条件下的尺寸约为470 nm。它们的多分散指数均为 <0.09，表明尺寸分布较窄。两种类型的NG都表现出预期的热，pH和离子强度响应行为（图S3）。ELS测量证实，在pH值高于pKA时，nNG的有效表面电荷为负，而在pH值低于pKA时，pNG的有效表面电荷为正（图S4）。我们通过对样品进行质子核磁共振（1H NMR）和红外光谱（IR）来量化NG的共聚单体含量。通过1H NMR测定APMH的定量含量为8.4mol%（图S7）。作为评估MAAc含量的方法，1H NMR是不合适的，因为NIPAAm和MAAc部分的信号重叠。使用红外线中相应的羧基信号进行定量。标记后MAAc的含量为8.0mol%（图S5，S8）。

标记的NG通过基于液滴的微流控合成被掺入MG网络中，这允许制造单分散胶体水凝胶，这些水凝胶可以通过改变有机相和水相的流速和含量来轻松调节.再次，NIPAAm和BIS用于凝胶网络。为了稳定油包水滴，在连续氟化油相中采用了不带电荷的表面活性剂FluoSurf，从而避免了可能影响反应的额外电荷。使用UV引发剂-苯基--三甲基苯甲酰膦酸锂（LAP）开始聚合，该LAP具有良好的水溶性和快速的UV反应性（365 nm）。众所周知，LAP可以抑制过早的凝胶化，在这方面，允许对光聚合进行空间和时间控制.我们决定使用UV引发剂而不是传统的偶氮引发剂，以避免加热分散体，因为这会诱导NG的沉淀。

对于微流控反应，将NIPAAm、BIS和LAP溶解在各自的NG分散体（10 mg/mL）中，以确保NG的均匀分布。为了获得聚电解质NiM−C，分散的水相包括nNG或pNG，并且仅使用一个入口（图S1）。为了制备聚两性溶解液NiM−C，两种类型的NG都是通过同时使用两种不同的水分散体（每个入口一个）来掺入的。在横流交界处（图1（A）），两种不混溶流体之间的剪切力导致形成油包水滴，然后通过混合部分（图1（B）），其中层流变为湍流，这是蛇形通道的结果.收集液滴后（图1（C）），乳液被紫外线照射。10 s的辐照时间是最佳的，因为发生了聚合，但光漂白效果保持在最低限度。样品之间MG尺寸的差异可归因于单体重量的微小偏差，或注射泵精度导致的流速差异。

纯化后，我们通过CLSM成像研究了NiM−C对荧光标记NG的形态和定位。对于两种类型的聚电解质NiM−C，图2显示了NG的统计分布，其中Rhod B标记的nNG为红色，Cy5标记的pNG为蓝色。两种NG物种在室温下在水中膨胀（图S3，（C）），因为携带相同电荷的部分之间的排斥静电相互作用和随之而来的天然反离子的渗透压.39我们假设这些相互作用也具有长期效应，因此，诱导空间分布的NG排列。PNIPAAm链的形成、生长和交联显然不会影响聚电解质NG在被聚合物网络捕获之前的胶体稳定性。纯PNIPAAm NG的参考实验显示，NG在MG网络内的分布同样均匀（图S9）。在不含带电共单体的中性NG中，胶体稳定性由悬链引起，而集成的引发剂衍生基团和Rhod B Ac标记剂会引起轻微的静电贡献。这些稳定机制很可能已经足以诱导NG的统计分布。与此相反，含有两种类型NG的多两性溶解质NiM−C表现出Janus样结构，其中两种NG物种形成高度相分离的凝聚物，这些凝聚物沉降在MG网络的一侧。正如叠加图像中的粉红色（图2，图3）所证明的那样，由nNG（红色）和pNG（蓝色）组合而成，凝聚物由两种NG物种组成。这一观察表明，带相反电荷的NG之间的有吸引力的静电相互作用是凝聚的驱动力，就像同一电荷的NG之间的排斥导致NG在整个MG网络中的空间分布一样。简单地混合两种聚电解质NG分散体不会导致可见或显微镜可检测到的凝聚（图S10，图4）。通过粘度测定，我们近似出分散体中NG的广义有效体积分数低于胶体玻璃化转变（图S11）。

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