微流控技术开发合成聚两性溶解液纳米凝胶胶体的新型分步方法（下）

测试了NiM−C对温度、pH值和离子强度的整体响应性。与温度相关的尺寸测量表明，在VPTT以上，NiM−C的直径减小，类似于纯PNIPAAm MG的去溶胀。然而，与文献报道的胶体PNIPAAm凝胶的VPTT相比，PNIPAAm MG和NiM−C（图3，图S12）的乙状结肠玻尔兹曼拟合确定的VPTT增加，这可以通过测量方法解释：虽然NG的流体动力学直径主要由自由浮动状态下的DLS确定，但显微镜下的尺寸测量可能受到载玻片和样品之间表面相互作用的影响。带电的NG对pH和离子强度有反应，而中性PNIPAAm NG仅在高离子强度下坍塌（图S3，（A））。鉴于我们的目标是设计一种能够正交药物递送的凝胶系统，NG必须在不同的环境条件下保持固定在MG网络中。为了研究聚两性溶解液NiM−C的pH和离子强度响应行为，将样品在物体载玻片上干燥，然后在各种缓冲液和盐溶液中再水化。CLSM图像显示，在所有测量的pH值（2.5至11.0）和所有盐浓度（1mM至1000mM）下，凝聚剂保持相分离（图S13）。由于nNG在pH值低于pKA（MAAc）≈5.0时脱阴，pNG在pH值高于pKA（APMH）≈10.0时收缩（图S3，S4），我们验证了即使在脱压状态下，NG也被固定在MG网络中。由于PNIPAAm本身具有离子强度响应性，因此由于溶质离子和聚合物链之间的溶剂化竞争，整个NiM−C在1000 mM时会收缩。由于电解质-水相互作用取代了聚合物-水相互作用，疏水效应占主导地位，MG网络崩溃。总体而言，多两性溶解液NiM−C的宏观响应度与纯PNIPAAm MG的响应度相似（图3，图S12-S14）。由于NG的膨胀和去膨胀不会影响整个NiM−C，因此中性MG网络似乎像海绵一样起作用，补偿NG大小的变化。NiM−C形态在所有测量的pH值和离子强度<1000 mM下都是稳定的。考虑到人体中存在的离子强度（100-200 mM），与游离多两性溶解物NG.40相比，NiM-C系统被证明对生物医学有利，为了研究凝聚机理，进行了微流体实验，其中油包水滴仅含有某些反应物。在紫外线照射前后拍摄每个样品的CLSM图像（图4）。使用与以前相同的基于液滴的微流控装置，我们首先制造了含有两种类型NG的水滴。根据先前的观察（图S10），它们在辐照之前和之后都没有凝聚（图4（A），（F））。仅添加LAP重复一次相同的实验，仅添加NIPAAm重复一次（图4（B），（C））。在第四个实验中，将NIPAAm和LAP都添加到NG分散体中，最后，使用所有用于合成聚两性溶解质NiM−C的反应物（图4（D），（E））。紫外线照射前的所有CLSM图像都显示NG在水滴内均匀分布，即没有发生凝聚。即使在紫外线照射后，含有NG物质和单体或引发剂的样品也没有表现出凝聚作用（图4（G），（H））。仅对含有两种类型的NG与单体和引发剂的样品以及另外含有交联剂的样品进行相分离，无论是在紫外线照射后，还是在LAP的自由基分解后（图4（I），（J））。液滴中同时存在单体和引发剂，因此可以进行聚合。因此，只有当（1）同时存在带正电荷和带负电荷的NG物质（图2）和（2）形成线性或交联聚合物时，才会发生凝聚。我们得出的结论是，除了静电相互作用外，耗尽絮凝是装配带相反电荷的聚电解质NG的重要驱动因素。简而言之，NG周围存在一个耗尽区，不能被生成的聚合物链穿透。当NG相分离时，它们各自的耗尽区重叠，因此聚合物的自由体积最大化。如果在聚合过程中仅存在相同电荷的 NG，则该耗尽力会与 NG 之间的静电排斥力竞争，因此 NG 在统计上分布在整个 MG 网络中（图 2）。然而，当两种NG物种都存在时，消耗力和静电吸引力会引发协同效应，从而触发凝聚效应（图4（I），（J））。因此，电荷的引入对于NiM−C内隔室的形成至关重要。

基于此，我们假设合成参数NG浓度、pH值和离子强度对相互作用动力学有显著影响。因此，改变这些参数使我们能够控制NiM−C内的内部形态和NG排列。首先，基于液滴的微流控合成中使用的NG分散浓度在5至30 mg/mL之间变化（图5（A））。每种NG中含有10 mg/mL的样品（与之前使用的浓度相对应）显示出最明显的相分离。在将浓度降低到每个NG分散体5 mg/mL的实验中，形成了较小的凝聚物。液滴中存在的 NG 数量较少导致 MG 网络内更高的空间分离，从而防止形成一个连续的凝聚物。随着NG浓度的增加，凝聚物的大小会增加，直到它占据MG网络的大部分。令人惊讶的是，在 30 mg/mL 时，整个 MG 网络充满了 NG，表现出类似核壳的子结构，其中 pNG 位于内部，nNG 位于外围。对于带相反电荷的聚合物的电荷化学计量溶液，已经证明，在一定浓度的聚电解质以上，凝聚被抑制并形成单相.43根据我们的观察，我们假设，在这方面，NG表现出与线性聚电解质链相似的行为。此外，最近的研究表明，在基于PNIPAAm的MG中选择共聚单体会改变其界面活性。基于MAAc和APMH部分的化学结构（图S7，S8），我们假设nNG的极性略高。因此，我们推断亲水性更强的 nNG 物种倾向于朝向亲水性表面活性剂头部，而疏水性稍强的 pNG 更可能位于 NiM−C 的内部。通过z堆叠CLSM图像检查了所有三种NG排列，以验证其三维外观（图S15）。

对于离子强度变化，将NG（10mg / mL）重新分散在离子强度在1至300mM之间的氯化钠溶液中（图5（B））。正如预期的那样，在盐浓度为1 mM的NiM−C中，相分离和凝聚最为明显。离子强度的增加导致 MG 网络中两种 NG 物种的凝聚减少和更均匀的分布。盐浓度越高，NG的电荷筛选得越多。这反过来又减少了NG之间的静电吸引力，这被认为是凝聚的驱动力之一。图5（B）中的CLSM图像验证了这一假设。在盐浓度为≥50mM时，电荷大部分被筛选，聚电解质NG被解泡。同样，NG的核壳状排列在NiM−C内部形成。根据我们的假设，我们认为NG在高盐浓度下的位置完全受其界面活性和疏水性的影响，因为电荷屏蔽消除了静电吸引力。

为了证明pH值对NiM−C内部结构的影响，通过使用离子强度为10mM的缓冲液来保持离子强度恒定.尽管缓冲液是专门用这些低离子强度制备的，但游离离子的量足以导致在NiM-C中NG内的某些电荷被筛选。当然，筛选仅与离子强度成正比，但即便如此，也足以使凝聚物在中性pH范围内消散。因此，必须将研究结果与在10 mM离子强度下进行的实验进行比较，而不是与在HPLC级水中进行的实验进行比较（图5）。正如MAAc和APMH的pKA所表明的那样，DLS和ELS证实了（图S3，S4），nNG在pH<4.0时不带电，而pNG在pH>10.0时不带电。由于添加NIPAAm和BIS后，nNG在酸性缓冲液中沉淀，因此无法测试pH值<5.0。nNG可能在pH 5.0下已经大部分质子化，因此由于在NIPAAm和BIS存在下发生的疏水效应而沉淀。图5（C）显示，在pH 7.0–9.6时，较小的凝聚体在空间上分布在整个NiM−C中。部分电荷筛选 （I=10 mM） 和 APMH 部分的质子化增加导致相分离不太明显。在 pH 值为 10.5 和 11.0 时，仅对 nNG 充电。由于只有负电荷之间的静电排斥力占上风，而吸引力减弱，因此形成了核壳状排列。

由于 Weitz 等人表明，当加热到 VPTT 以上时，基于热响应的 NIPAAm 的 MG 会在水滴中沉淀，因此除了静电相互作用和耗尽絮凝外，温度在 MG/NG 的凝聚中起作用.进一步的实验应旨在了解反应温度对 NG 凝聚的影响。此外，应研究具有核壳状排列的NiM−C，以验证NG的疏水性和界面活性至关重要。关于我们设计具有相反电荷隔室的药物递送系统的目标，对决定性相互作用的更深入理解提供了对NiM−C结构及其作用模式的控制。初步实验验证了NiM−C中带电模型药物的摄取和触发释放（图S16，S17）。然而，需要进一步的优化和分析来提高货物分子的吸收和排出效率，并验证对多种药物的适用性。由于NiM−C是通过两步法制造的，因此原则上可以通过改变微流控芯片的通道直径来调整NiM−C的尺寸。已经确定，使用基于液滴的微流控，可以制造直径在10μm和1000μm之间的微凝胶.24根据NiM−C的所需尺寸，还必须通过调整沉淀聚合中的反应条件来减小NG的直径。通常，对于选择合适的尺寸，计划的药物配方是决定性的：虽然已经为静脉注射到血液中的药物输送系统指定了 100-500 nm 的理想尺寸，但例如，可吸入药物载体的尺寸应在 0.5-5 μm 之间.由于所提出的 NiM−C 表现出独特的 pH 响应性， 通过口服给药在胃肠道中释放靶向药物是可以想象的。然而，也可以测试其他治疗剂型，如透皮摄入.50在任何情况下，NiM-C的大小，表面功能化和可降解性都需要优化，以改善其体内性能。

在这项工作中，我们建立了一种简单的分步合成路线，用于制造聚电解质和聚两性溶解质纳米微凝胶胶体（NiM−C）。采用共聚焦激光扫描显微镜观察NiM−C内NG的定位和排列。MG网络形成后pH值和离子强度的变化表明，NiM−C的形貌在不同环境条件下保持完整，NG牢固地固定在MG网络中。我们认为，不同电荷NG之间的静电吸引力和聚合物链的产生引起的消耗力的结合是NG凝聚和相分离的主要驱动力。因此，仔细选择合成参数NG分散浓度、pH值和离子强度可以控制NiM−C的内部形貌，以产生相分离或统计分布的NG共凝聚物以及NG的核壳状排列。相分离的凝聚物仅在低离子强度（I <5 mM）和NG浓度为10 mg/mL的HPLC级水（pH≈6.5）中获得。

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