进样和样品预处理技术

按照芯片实验室工作的一般流程，进样和样品预处理是首当其冲的两个环节，它们将原始样品送入系统转换为适于运行的形式，并保证最终样品处理结果的质量和可靠性。从芯片实验室概念提出至今，已经累积了一整套进样和样品预处理技术，它们是芯片实验室发展的重要基础。

利用芯片平台处理样品，首先需要将样品引入芯片的样品处理通道或通道网络，该步骤通常称为进样(sample loading)。进样通常又可分为上样和取样两个步骤。芯片样品处理通道粗细与人类的毛发相若，如何将样品从外部宏观世界以可控的方式引入微观通道内部一直是芯片实验室领域的一个研究热点(图5-1)。

进样是芯片实验室的关键技术之一，引入样品的量、形态和方式等均会对后续样品处理产生影响，因芯片体系微小，这种影响有时甚至是决定性的。稳定、可靠的进样是芯片实验室产业化的必要条件之一。

待进样的样品可存储于芯片上的储液池，从储液池进样快捷，但样品容量偏低。样品也可存储在芯片外，此时样品通过导管进入芯片(图5-2(a))。外置样品源容量大，可满足长时间连续进样。

芯片进样可由电场、注射泵、静压力、表面张力等不同的方式驱动(图5-2 (b))。一般意义上的进样通常针对液态样品，气态样品也可直接进样，固态样品在微粒化后，经过液/气流携带也可被引入芯片样品处理通道。

(a) 两种进样模式示意:()储液池模式(样品存储在芯片储液池内，由储液池进入芯片微通道);(I) 导管模式(样品存储在芯片外，由导管引入芯片微通道);(b)四种进样驱动方式示意(I)电场驱动模式(电极置入微通道两端的储液池中，所产生的电场即可驱动微通道中的液体)，(I)注射泵驱动模式，(Ⅲ)静压力驱动模式(液体从高液位芯片储液池流向低液位芯片储液池)，(IV)表面张力驱动模式(微通道内弯曲液面所产生表面张力可作为流体驱动力)

5.1 液态样品进样

芯片实验室处理的对象是流体，液态样品进样是芯片进样的主流，实际中主要有三种情形:向样品处理通道内引入样品区带，引入样品液滴和引入持续样品流。

5.1.1 区带样品进样

向芯片样品处理通道内引入样品区带是芯片电泳、芯片色谱、芯片电色谱等芯片实验室重要单元操作实施的先决条件。样品区带的量、长度等

指标对于单元操作的结果有重大影响。如何向通道内引入可控样品区带自微流控芯片概念提出以来一直是一个研究热点。

5.1.1.1 单通道辅助进样

经样品源向芯片样品处理通道内输入样品区带通常需要其他手段辅助，最简单的方法是设置一条辅助通道，该法被称为单通道辅助进样，通常分两步，上样和取样(图5-3)。

图5-3 单通道辅助进样

(a)进样过程示意和对应的荧光显微照片:(I)上样:将样品从样品源引入辅助通道，在十字交叉口处形成一区带;(II)、(III)取样:将十字交叉口处区带引入样品处理通道，通过十字交叉口的几何尺寸控制区带的长度和量;(b)典型的单通道辅助进样芯片设计

单通道辅助进样按上样和取样的驱动力的不同可分为完全电动单通道辅助进样、完全压力单通道辅助进样和压力电动单通道辅助进样等几种。

完全电动单通道辅助进样

完全电动单通道辅助进样简称电动进样，指的是一种仅以电动力(包括电泳力和电渗力)为驱动力，通过电压切换，在十字交叉处形成样品区带并将其引入样品处理通道的方法。电动进样操作简便，易于实施，是目前主流的单通道辅助进样技术。

依据电压施加策略的不同，这种进样方式又可分为简单进样、悬浮进样、压缩进样和门进样等(图5-4)。

图5-4 各种电动进样方法原理示意

(a)简单进样;(b)悬浮进样;(c)压缩进样;(d) 门进样存储不同溶液的芯片储液池，1.样品池，2.样品废液池，3.缓冲液池，4.缓冲液废液池

简单进样和悬浮进样方法上样和取样都只涉及单方向电场，操作简单，在预实验中较常用(悬浮指的是电极不施加电压的状态)，压缩进样方法涉及多方向电场，可较好地控制样品区带的量和长度，在实际中使用较多(图5-3(a)荧光照片所示即为压缩进样过程)。门进样方法可向样品处理通道内连续输入区带，缺点在于输入区带的形态不甚规则。所有电动进样方法均服从基尔霍夫定律，即在任一时刻，各段流路内的电场强度的矢量和等于零。在图5-5所示的十字芯片中，基尔霍夫定律可表达为E1+E3+E2+E4=0。

电动进样的主要缺点是其存在一种进样歧视效应，指的是一种因样品中各组分电动性质相异而导致样品区带不能代表实际样品组成的现象，其具体机理因进样类型而异且在上样和取样阶段同时存在。在上样阶段，门进样因进样量与上样时间有关，歧视效应发生的机理为，在相同进样时间内，因不同组分的电动淌度相异，淌度大的组分进样量大，淌度小的组分进样量小，是一种淌度电歧视。而对简单进样、悬浮进样和压缩进样而言，理论上只要上样时间足够长，保证所有组分均通过十字交叉口则上述淌度电歧视效应可避免，但研究表明上样过程中溶液离子强度的变化和因电极附近缓冲液的电解所产生的流体系统pH值漂移也可诱导一定的歧视效应。较之上样阶段，对取样阶段电歧视的研究则相对滞后，目前了解的情况是这种电歧视与样品组分分子所带电荷的种类及上样通道与分离通道的宽度比有关。

此外，门进样除存在淌度电歧视外，还存在弯角电歧视，因此不推荐其作为复杂样品定量分析的进样方法。弯角电歧视指的是由于样品各组分电动淌度不一致，使其自身在经过十字交叉时因转弯半径不一致所引起的歧视效应。

完全压力单通道辅助进样

仅利用压力将样品区带引入样品处理通道的方法称为完全压力单通道辅助进样，简称压力进样(图5-6)。

图5-6压力进样方法原理示意

(a) 预备状态、(b)上样，(c)取样，通过(b)、(c)之间的反复切换可实现连续进样

压力作用下流体的行为与样品组成、管壁带电状况等基本无关，因此压力进样方法所引入的样品区带在很大程度上可代表样品中各组分的真实组成，但向微通道内施加压力操作比较繁杂，所需设备也较精密和昂贵，有一定的技术门槛，此外，压力进样方法并不涉及电场，因此，完全压力单通道辅助进样方法的实际应用面较狭窄，主要集中于芯片液相色谱类操作。

压力电动单通道辅助进样

压力电动单通道辅助进样是一种上样驱动力为压力，取样驱动力为电动力的进样方法，简称压力电动进样。典型案例是作者课题组开发出的一种静压力电动进样方法(图5-7)。

图5-7静压力电动进样方法(示意图和荧光显微照片)

压力电动进样方法因采用压力上样而使样品区带能够代表样品中各组分的真实组成，又因采用电动取样而与芯片电泳、电色谱等重要芯片实验室单元操作兼容。类似于完全压力进样，压力电动进样的推广受限于压力上样的技术门槛，但因产生压力的方式多种多样，该法在一段时期内是科学研究的热点之一，除静压力电动进样方法外，其它种类的压力电动进样方法还有注射泵致压力电动进样[7]、气动微泵致压力电动进样等。

样品池、缓冲液池、缓冲液废液池和样品废液池内溶液的体积分别为13、10、10和2μL。(a)预备状态(施加电场使缓冲液从缓冲液池流向样品废液池，形成一个“门”，样品在静压力作用下从样品池流向样品废液池，在“门”的作用下，样品不能进入样品处理通道);(b)上样(将缓冲液池和样品废液池切换为悬浮状态，样品即在样品池与缓冲液废液池间的静压力作用下进入样品处理通道);(c)取样(上样30s后，恢复预备状态电压设置，一段样品区带便被导入至样品处理通道);(d)上样荧光显微照片;(e)取样荧光显微照片

5.1.1.2 多通道辅助进样

设置多条辅助通道，向样品处理通道内输入样品区带的方法称为多通道辅助进样。典型案例包括双十字静压力进样方法[1(图5-8)、双十字电动进样法、多T电动进样法等。

图5-8所示即为作者课题组开发的双十字静压力电动进样法。在原有十字交叉结构的基础上增加了一个十字交叉结构，双十字间距离十分接近，从几微米至几十微米不等。上样时，样品废液池置空，其余储液池内则加入一定体积的溶液，在静压力驱动下，样品从样品池1经桥流入样品废液池，待两个十字交叉口处充满样品后，在辅助通道2和分离通道内同时施加相同大小的电场实施取样，分离通道十字交叉口内的样品在电场作用下流入分离通道，形成样品区带，而来源于样品池的静压力样品流则被电场经十字交叉口转入辅助通道2，不会流入分离通道干扰随后的电泳分析，如图5-8 (a)所示。

由于两条辅助通道的设置，双十字静压力进样方法可对样品区带实施精细调节，实验表明，对于罗丹明123样品，在一定范围内，进样量和所加旁路电场大小呈现出良好的线性关系，如图5-8(b)所示。这种线性关系在荧光素纳样品上也得到证实。

图5-8 双十字静压力进样法

在图5-9(a) 和(b)中，其进样所需的电极数可被降至两个。该法的缺点是芯片微通道网络设计稍显复杂。

电极数目与芯片电泳仪的搭建难度、成本，电泳实验操作难度关系密切。芯片电泳仪所需电极的最小数目为二。因此，两电极双十字静压力进样法可将芯片电泳仪的搭建难度和成本降至最低，同时降低电泳实验操作难度，便于芯片电泳技术的推广和普及。

两电极双十字静压力进样法还可降低阵列芯片电泳进样所需电极数，最低也可降至两个(图5-9 (c))。

图5-9 双十字静压力进样方法对电极数目的减小作用

(a)双十字静压力进样方法:由四电极到两电极;(b)基于两电极双十字静压力进样方法的蛋白质电泳谱图;(c)两种基于两电极进样设计的阵列电泳芯片及对应的染料阵列电泳谱图

5.1.1.3 激光辅助进样

若样品带有荧光且采用荧光法检测，可不设辅助通道，而利用强激光对样品的漂白作用直接在分离通道内形成样品区带。该法实质上是一种门进样，“门"为强激光束。如图5-10所示。大功率的激光束被分光器分为能量不同的两束，其中能量大(75-750mW)的作为“门”光束被聚焦到通道上游靠近样品池处，能量小(2mW)的光束则被聚焦到通道下游作为检测光束。在上样开始前，样品在通道两端电场的作用下持续流出样品池，在通道上游流经大能量“门”光束时，经其漂白变为非荧光化合物，并与缓冲液一起流经检测光束，在电泳谱图上形成基线。这种情形等效于“门”处于关闭状态。上样时，由一光闸挡住"门”光束，“门"随即开启，一段荧光样品因未被漂白而进入下游分离通道，形成样品区带。“门”开启的时间越长，进样量越大。类似于前述几种门进样方法，光门进样同样可连续进样且速度较快，此外芯片设计简单，易于阵列化，但因激光不能完全漂白荧光化合物而导致其基线噪音较大，检测限偏高。

图5-10 激光辅助进样(a) 原理示意;(b)典型的连续进样谱图

5.1.2 液滴样品进样

液体可以以不连续微小液滴的形式存在于与之不相溶的另一种液体中，这种两相体系称之为乳液(emulsion)。乳液既与人类的生活密切相关，又是科学研究的一个重要平台。日常用的化妆品很多便以乳液状态存在，而乳液中微小的液滴又可以支撑多种生化研究，甚至有科学家提出了“液滴实验室”的概念。如何向芯片样品处理通道内引入液滴成为芯片进样领域研究的一个热门课题。

以连续液滴为特征的微流控芯片称为液滴微流控芯片(图5-11)。液滴微流控芯片是芯片实验室领域的一个重要分支。本书第8章将对该分支做详细介绍。

当油相和水相流动速率之比为合适数值时，从T型交叉口处可以向样品处理通道连续输出液滴;当样品处理通道为蛇形时，液滴在迁移时内部存在一个自动混合过程

5.1.3 连续样品进样

将液体持续导入至样品处理通道称为为连续样品进样。连续样品进样是芯片有机合成、液液萃取、细胞培养等领域的一项基础技术。理论上，只要样品源与微通道连通，辅以持续的驱动力，就可以实现连续样品进样。实际中，一个大的挑战在于如何方便快捷地实现持续、稳定、自动化的连续样品进样。

作者所在实验室开发出一种基于”表面张力-蒸发”平衡效应的连续进样方法(图5-12)，该法在不需要芯片外部设备，控制软件和动力源的条

件下实现了持续、稳定、自动化的连续样品进样，而且进样装置的体积和成本都极小，操作也无需专业技巧。该进样方法很可能在家庭化的芯片实验室中得到广泛应用，对芯片实验室产业化也有一定的促进作用。

图5-12 基于“表面张力-蒸发"平衡效应的连续进样方法

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