药物筛选新技术及其应用进展

医药产业是事关国家未来经济社会发展的重要战略性产业，是世界公认的最具发展前景的国际化高技术产业之一。新药研发带来的新技术创新和新品种上市是推动医药产业发展的源动力。随着现代科技的发展，计算机模拟设计、化学合成、生物提取、天然产物提取等领域的技术突飞猛进，使得目标化合物的获取更加快速高效，并在此基础上建立了以来源、结构、作用等不同特点进行分类的各种化合物库，化合物库的样品数量从几百到上百万不等。如美国 ChemDiv 公司拥有全球最大的小分 子化合物库，除了目前库存的125 万种化合物以外，每年以15 万种新化合物的速度递增。我国的化合物样品库储量在2015 年将超过100万个，具有结构多样化、存储专业化、管理集中化、信息系统化和质控标准化等特点。如何从海量的化合物中筛选出有药理活性的化合物或先导化合物，是目前医药行 业的研究热点之一，也是各科研院所、医药公司倾力投资发展的一个重要方向。

药物筛选是指对可能作为药物使用的各种物质，包括化学合成的化合物、蛋白多肽、天然产物、 海洋产物等，应用适当的筛选方法和筛选技术，检测其可能存在的药理活性，为开发新药提供实验依 据的方法，是连接药物从实验室研究到临床应用的重要纽带，也是提高研发效率、缩短周期、减少成本、降低风险、使新药研发能够持续进行的关键。药物筛选的历史悠久，所采用的技术、方法也在不断进步，新技术的应用，促进了药物筛选的发展和进步。应用新的药物筛选技术也成为医药科学研 究的重要内容。本文就近年来新发展的药物筛选技术并结合现有的药物筛选技术及其应用进行了简要综述，主要包括高通量筛选技术、高内涵筛选技术、表面等离子体共振技术及微流控芯片药物筛选 技术。

1  高通量筛选技术

1.1  高通量筛选技术的发展

高通量筛选( High throughput screening，HTS) 技术，首先需要配备快速处理样品的全自动工作站，灵敏快速的检测仪器和强大的计算机控制系统等硬件设备，以分子水平或细胞水平的实验方法为基础， 以微孔板作为实验工具载体，通过程序控制，同一时间对数以千万的样品进行检测，并以相应的数据 库系统支持整体运转的技术体系。HTS技术大多是以光学检测为基础而建立的分子水平或细胞水平 的分析检测方法，包括光吸收检测、荧光检测、化学发光检测等。由于HTS 在创新先导物的发现过程中具有快速、高效、微量等特点，虽然其出现只有几十年时间，却已在全世界新药研究机构、大型医药公司的创新药物发现过程中广泛应用。HTS 模型以分子水平居多，筛选的靶点包括离子通道、酶和 受体等。HTS通常以单一的筛选模型对大量样品的活性进行评价，从中发现针对某一靶点具有活性的样品。靶标库和化合物库的建立，不仅为创新药物的发现提供了机遇，也对 HTS 效率提出了新的要 求，使HTS朝着日筛选规模越来越大，速度越来越快的方向发展。目前已形成了可日筛选10 万样次的 超高通量筛选技术( Ultra high throughput screening，uHTS)。

1.2  高通量筛选技术的应用

潘丽等建立了稳定可靠的以转导与转录激活子( STAT3) 为靶标的抗肿瘤HTS模型，应用该模型 对8,248 个潜在的抗癌药物进行筛选，抑制率在80%以上的有5 种，在500 μmol/L 药物浓度下，化合物MDC6 的抑制率最高为92%，为后续MDC6 的抗癌研究提供了可靠的前期数据。罗睿等建立以蛋白激酶A为靶点的抗结核药物HTS模型，利用该模型对4,000个微生物发酵液粗提物样品进行筛选，最终得到21个抑制蛋白激酶A 活性的阳性样品，阳性率为0.53%；以耻垢分枝杆菌和海分枝杆菌为检定菌，平板纸片法检测阳性样品的抗分枝杆菌活性，然后对HTS 筛选的阳性样品的细胞毒性和酶活抑制特异性进行评价，最终得到8个阳性样品，其中有4个阳性样品的酶活抑制特异性、抗菌活性均较好，且细胞毒性较低，证明该筛选模型得到的阳性药品值得进一步研究。随着耐药菌株的出现，抗生素的研发变得更加紧迫。应用HTS技术，能快速从人工合成化合物库或天然产物化合物中筛选出具有潜在抗菌活性的物质。Duetz等提供的高通量发酵技术能在96 孔板中进行菌种发酵，发酵过程能与自动化的提取和扫描平台整合。该方法能够在较短时间内研究多达20 种不同的培养基质对微生物次级代谢产物的影响。平板霉素正是采用这种新筛选方法得到的产物。流感病毒的PA_N 蛋白高度保守，且具有核酸内切酶活性，是抗流感药物研发的潜在靶点。张国防等采用HTS体系，从372 种化合物中筛选出3 种对流感病毒H5N1 的PA_N蛋白抑制作用较好的化合物。将这3 种化合物分别与 PA _N蛋白进行分子对接模拟，结果显示它们均可与 PA_N 蛋白活性位点的二价金属离子和氨基酸残基相互作用，从而为抗流感病毒药物的发现提供了先导化合物。Canavaci 等建立了用化学发光方法检 测β-半乳糖苷酶的HTS模型，以384 孔板为载体，筛选了NIH 化合物库中的303 224 种化合物，得到4,394 种能对抗美洲锥虫病的阳性样品，随后的毒性检测显示，其中有3,005 种化合物的 IC50 ＜10 μmol/L。本课题组将由Tecan公司的全自动工作站及其连续波长多功能酶标仪组成的高通量筛选系统用于自主合成的化合物，包括β2 受体激动剂、PDE4 抑制剂、乙酰胆碱酯酶抑制剂以及自由基清除剂的大量筛选，得到了具有潜在药理活性的先导化合物。  

2  高内涵筛选技术

2.1  高内涵筛选技术的发展

细胞生物学研究已成为生命科学研究领域中最为重要的部分，尤其是步入到后基因组时代，科学家不再简单割裂地研究单个基因或单个蛋白的功能，而是开始从一个功能整体的角度考虑问题。HTS 技术单指标的筛选方法，已经不能满足药物发现的需要，而且也不利于对化合物活性的综合评价。因此，以多指标多靶点为主要特点的高内涵药物筛选( High content screening，HCS) 技术应运而生。

HCS的仪器一般由白色连续光源、多通道滤光片( 适于常用的荧光染料) 、显微镜模块和高速高分辨率 的CCD照相机进行图像获取，同时还可以配备细胞培养和自动加样模块进行长时间全自动的实验分析。基于激光的硬件聚焦系统使得自动对焦在200 ms以内，再结合软件聚焦，完善了对拍摄对象的快速定位和图像获取。除了图像获取部分外，图像采集、图像分析和数据储存也是高内涵药物筛选设备 的主要组成部分。

20 世纪70 年代Talyor等最早提出高内涵概念，此后该课题组一直致力于开发定量研究细胞的新工具，1996 年，Talyor成立了 Cellomics 公司，并于1999 年研发生产了世界第一台商用 HCS 仪器。

进入21 世纪，单克隆抗体技术、细胞的制备方法、荧光染料的开发、仪器设备的改进以及计算机的发 展，使得HCS技术作为一门生物检测技术已经日臻完善，应用领域日趋广泛。

相对于HTS结果单一，HCS是筛选结果多样化的一种筛选技术手段。HCS 模型主要建立在细胞水平，通过观察样品对固定或动态细胞的形态、生长、分化、迁移、凋亡、代谢及信号转导等多个功能 的作用，涉及的靶点包括细胞的膜受体、胞内成分、细胞器等，从多个角度分析样品的作用，最终确定样品的活性和可能的毒性。HCS 技术克服 了以往细胞研究领域的“串行”研究方法（即细胞周期→细胞毒理→信号转导→代谢调控等）效率低、速度慢的弱点，在同一实验中， 可完成各种对于细胞生理现象本质的研究。

这不仅大大提高了研究效率，降低了研究成本，避免了大量的重复劳动，同时获得了比之前成倍，甚至成百倍的海量数据，为各项研究提供了第一手实践材料。图 1 直观比较了HTS和HCS的共同点和差异性。从实验载体上看，HCS 与 HTS 无显著区别，均是在微孔板( Microplate) 上进行，两者的样品消耗量一致，实验操作同样简单可行、自动化。

从实验结果看，HTS 实验结果单一，通常只获得每个样品孔的最终读数。而 HCS 的实验结果多样化，既有样品孔的最终读数，还有细胞计数、细胞形态学分析、细胞空间结构分析、细胞成像等多种实验结果。

图1  HTS和HCS的共同点和差异性比较

2.2  高内涵筛选技术的应用

Baniecki等将HCS用于寻找抗疟新药，认为使用基于图像的 DAPI 恶性疟原虫生长实验，可以 检测到单个疟原虫；而使用DAPI恶性疟原虫生长实验和［3H］标记的次黄嘌呤实验，96 孔板上得到 的读数结果显示，具有活力的疟原虫比例为0.25%。两种实验手段的结果比较表明，HCS 的灵敏度及 可靠性显著提高。Xu等针对一系列与肝毒性直接相关的细胞表面形态变化，建立了一个 HCS 检测 方案。在检测300 多种药物和化合物（其中包括许多可以导致人类罕见的肝毒性药物）时，使用该检测 方案，检出率达50%～60%，假阳性率非常低，仅为0～5%。Moffat 等建立了一种基于 HCS 的方法，来鉴定有丝分裂进程中所必须的基因，并针对5,000 种表达独特的shＲNA、以1,028 个人类基因作为靶点的慢病毒载体进行筛选，筛选到约100 个( 新型) 增殖相关的候选调控元件。此外，在药物毒性 筛选方面，采用基于荧光成像的 HCS 进行筛选，能够从单个细胞水平观察到细胞内部正在发生的事件，实验结果比传统的MTT法的灵敏度更高，信息量更大，结果更可靠，从而降低了后续的药物开发研究失败的风险。本实验室建立了以核转录因子NFκB为靶标的NFκB－U2OS细胞质核转染高内涵筛选模型，通过自动获取细胞质与细胞核的荧光强度差值，阳性组的差值比阴性组差值大8 倍以上，说明 NFκB 在药物刺激下入核明显。96 孔板方法评估因子 Z － factor≥0.5。这一模型适于以NFκB为靶标的高内涵药物筛选。

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