药物筛选新技术及其应用进展下

3  表面等离子体共振技术

3.1  表面等离子体共振技术的发展

表面等离子共振（Surface plasmon resonance，SPR）是指当一束平面单色偏振光以一定角度入射到镀在玻璃表面的薄层金属膜上发生全反射时，若入射光的波向量与金属膜内表面电子的振荡频率一致， 光线即被耦合入金属膜引发电子共振，即表面等离子共振。由于共振的产生，会使反射光的强度在某 一特定的角度大大减弱，反射光消失的角度称为共振角。共振角的大小随金属表面折射率的变化而变化，而折射率的变化又与金属表面结合物的分子质量成正比。由此，在20 世纪90 年代发展了应用 SPR 原理检测生物传感芯片( Biosensor chip) 上的配体与分析物作用的新技术。在该技术中，待测生物分子被固定在生物传感芯片上，另一种被测分子的溶液流过表面，若二者发生相互作用，会使芯片表面的折射率发生变化，从而导致共振角的改变。而通过检测该共振角的变化，可实时监测分子间 相互作用的动力学信息。虽然SPＲ筛选通量不及HTS和HCS，但其不需任何标记，能在更接近生理溶液的环境中直接研究靶标和分析物的相互作用，使之在药物研究中占据着重要的一席之地。随着商品 化SPＲ生物传感器仪器技术的逐步成熟，仪器的管路系统、进样方式及检测速度等也发生了巨大变化，从最初的单点单通道分析到多通道阵列式分析，在分析通量和数据质量方面有了很大改进。 近年来在药物筛选领域得到了广泛应用。图2 展示了不同时期SPＲ芯片的通路变化，其中A为一对 一模式，每个位点相互独立，任何一个样品只能流过其中某一个通道，通道间不能互为对照。B 是Biacore 3000 型芯片格式，4 个位点用管路相连，任何一个位点可以为其它3 个位点做空白背景的对照；C是Biacore T100 型芯片格式，1-2 通道和3-4 通道直接相连，使相邻的两个位点间距离明显缩短， 对照效果更好，基线更平稳；D是Biacore S51 的芯片格式，可以同时分别进4 个样品，任一通道均可 作为对照通道。G被衬为一次动力学模式芯片，是 Bio-Rad ProteOn XPR36 的芯片格式，可以一次性 平行标记6 个配体，芯片再旋转90°，在垂直方向平行流过6 个分析物或者6 个不同浓度梯度的同一分 析物，一次进样可完成两个分子间的动力学监测。

图2  各种SPＲ传感器的芯片格式

3.2  SPＲ技术在药物筛选中的应用

随着SPＲ技术检测灵敏度的提高，SPＲ的检测对象不再局限于大分子之间的相互作用，也可以实现蛋白质－小分子、核酸－小分子之间相互作用的检测。由于SPＲ技术能够直接反映两个分子间相互 作用的强弱和动力学模式，所以采用SPＲ方法可对蛋白化合物库、小分子化合物库等进行筛选，假阳性率大大降低。Geschwindner等采用 SPＲ 筛选以蛋白片段为靶标的小分子活性化合物，比传统检测方法得到更多的活性物质，且SPＲ方法的Z－factor( 为0.67) 远高于传统的检测方法( 为0.37) ， 说明SPＲ筛选方法所得结果更稳定可靠。G 蛋白偶联受体( GPCＲs) 是细胞信号传导中的重要蛋白质， 其拓扑构象为7 次跨膜的受体，同源性较低，当膜外的配体作用于该受体时，该受体的膜内部分与 G 蛋白相互结合，激活G蛋白。大多数的细胞激素和神经递质细胞内外的交流通过GPCＲ信号通路完成， 药物作用于GPCＲs从而达到治疗目的。迄今已发现作为治疗药物靶点的蛋白总数约500 个，而GPCＲs 靶点占其中受体的绝大多数。很多科研工作者先后进行了用 SPＲ 技术筛选 GPCＲ 配体及药物的研 究。本课题组利用ProteOn XPＲ36 仪器，建立了分别以 DNA、ＲNA 和 POT1 蛋白、Aβ 蛋白等为 靶标的小分子药物筛选模型，可对源源不断新合成的化合物进行初步的活性筛选，为化合物的进一步 开发研究提供了非常有参考价值的实验数据。

4  微流控芯片技术

4.1  微流控芯片技术的发展

在毛细管电泳发展的基础上，20 世纪90 年代Manz等提出了微全分析系统，即微流控芯片( Microfluidic chip) 或芯片实验室( Lab on a chip) ，它是将化学和生物等领域中所涉及的样品制备、反应、 分离、检测及细胞培养、分选、裂解等基本操作单元集成或基本集成到一块几平方厘米(甚至更小) 的芯片上，由微通道形成网络，以可控流体贯穿整个系统，用以取代常规化学或生物实验室的各种功能 的一种技术平台。经过几十年的飞速发展，微流控芯片系统的芯片制作、检测器研制、加样操作等 相关技术已日趋成熟并规模化，其应用范围覆盖了医学、药学、生命科学、环境科学等诸多领域，在药物筛选方面也得到了非常广泛的应用。并凭借其样品及试剂消耗少、分析速度快、效率高、操作模式灵活多变，以及可在生理环境或接近生理环境下运行等优点，为大规模高通量药物筛选提供了 绝佳的实验和检测技术平台。微流控芯片是最有可能满足高通量筛选要求的新兴技术平台之一。

4.2  微流控芯片技术在药物筛选中的应用

在微流控芯片上进行药物筛选，可大致分为分子水平、细胞水平和整体动物水平3 大方面的药物 筛选。在分子水平的药物筛选中，美国 Caliper Life Sciences 公司将微流控芯片技术应用于药物筛选领域，开发了微流控芯片实时动力学检测功能的 EZ Ｒeader 系列药物筛选平台，在不加中止试剂的情况 下检测酶学实验。用于实验的底物是带有荧光标记的多肽，底物在反应体系中酶的作用下转变为产物，其所带的电荷也发生相应的变化，利用底物和产物所带电荷的不同，将二者在芯片通道中进行分离，并分别检测。在检测过程中，96 或384 孔板中的反应物通过芯片底部的吸样针被吸入芯片通道。由于 在芯片的分离通道上施加了分离电压，带有荧光标记的多肽底物和反应产物由于电荷的不同而被分离， 然后在检测窗口进行检测( 见图3) 。在检测每一个样品时，可以同时看到底物和产物的信号。该系统可用于大规模的激酶抑制剂筛选。本课题组已在 EZ Ｒeader 平台上开展激酶抑制剂的筛选研究。在细胞水平的药物筛选上，微流控芯片也具有独特优势。它可以将细胞种植、培养、标记、刺激、加药、梯度稀释等操作通过微通道网络流体控制技术集成到一张芯片上完成，保持了细胞结构的完整性，可全面记录细胞对药物刺激的各种反应。Ye 等构建了一套用于细胞水平药物筛选研究的集成化微流控芯片系统，芯片结构的主体部分是由8 个 金字塔形的浓度梯度生成器网络结构围绕一个公共的废液池构成，网络结构单次可产生64 种药物作用条件，并获得192种细胞生物信号。为了进一步提高药物筛选的准确性，在体的药物筛选越来越受到人们的重视，并且为了降低筛选成本，会优先使用 一些模式生物来筛选药物，如秀丽隐杆线虫、斑马鱼胚胎等。微流控芯片则成为实现整体动物水平药 物筛选的良好平台。本课题组在微流控芯片上建立了斑马鱼癫痫模型，研究了维生素C和苯 妥英钠对斑马鱼幼鱼癫痫的解救作用。此外，《分析测试学报》近期策划的专题——— 《微流控技术在 分析检测中的应用》，对我国微流控技术在分析检测领域的最新研究成果进行了总结与集中报道，其中 也凸显了微流控技术在药物筛选中的应用优势。

图 3  微流控芯片分离检测酶产物和底物的示意图

5  展  望

新药开发，有助于治疗人类所面临的各种重大疾病，提高患者的生存质量，延长寿命，而药物筛 选则是发现新药的关键环节。药物筛选新技术的应用，能更快速有效地从庞大的化合物库中筛选出有 药理活性的药物，提高新药开发速度，降低新药研发成本。药物筛选新技术之间的相互融合匹配将能 更好地达到药物筛选的目的。比如HTS技术可借鉴HCS的成像系统，将检测对象的反应过程通过精密 数码相机记录下来，为药物活性评估提供更全面的信息。HCS 的发展可更加切实地做到高内涵筛选，

目前已发表的有关HCS论文中，60%～80%的文章只用到双通道成像检测细胞对药物刺激的变化，离 多通道高内涵检测还有一定距离。经过HTS和HCS 筛选的靶标和药物，可以采用 SPＲ 技术进行二次筛选，以进一步确证药物的活性，降低药物开发的投资风险。微流控芯片技术由于其微型化集成化的特点，有望集成HTS、HCS以及SPＲ筛选技术于一体，既能在分子水平评估药物活性，也能在细胞水平监测药物对细胞的影响，从而更加全面完整快速地对药物进行筛选。毫无疑问，随着科技进步及社会发展的需要，新的药物筛选技术会不断出现，各种新兴技术各自发展又相互融合是未来药物筛 选技术的发展方向，这将为新药开发提供更强有力的技术支持，从而为人类的健康带来福音。

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