微流控系统对样本中病毒的快速捕获/识别

大家好！为大家介绍一篇 2020 年发表在PNAS的文章，题目为 “A rapid and label-free platform for virus capture and identification from clinical samples” 。文章由The Pennsylvania State University的Mauricio Terrones课题组和New York University的Elodie Ghedin课题组合作完成。文章介绍了一种含有碳纳米管阵列的微流控芯片，根据尺寸的物理参数，在3分钟内实现样品中病毒分离，并对其进行快速分析、鉴定，准确率可以达到90%。该平台不仅可以进行快速病毒样本分析，富集后的病毒样品还可以回收并进行下游分析。Mauricio Terrones课题组的研究方向是多维度碳纳米材料的开发应用，及纳米器件的设计开发，课题组网页是https://sites.psu.edu/terronesresearch/；Elodie Ghedin课题组的研究方向是利用基因组学、分子病毒学和计算生物学的工具定义人类寄生虫和其他病原体的基因组特征，课题组网页是https://wp.nyu.edu/ghedinlab/。

[背景]

病毒种类多样且进化速度迅速，目前有上百万种未知病毒具有潜在的传染人类的风险。因此迅速查找并确认病毒种类成为控制传染病以及传染病学中重要的一环。在传播的早期，发现和纯化相应病毒是控制传染的第一步。现有技术的突破主要是通过新一代的快速测序技术等基因工具来对分离或者培养后的病毒进行检测，用以确定病毒种类。然而漫长的培养不仅引入病毒变异的可能，也浪费了宝贵的时间，对于病毒进行快速有效的监控具有一定挑战性。

[VIRRION 平台]

作者开发了一套完整的高通量样本制备平台，结合碳纳米材料、微流控芯片及快速拉曼光谱仪，用于快速进行多种病毒的富集和无标签化检测。该平台命名为VIRRION（virus capture with rapid Raman spectroscopy detection and identification）。相比于之前他们的工作中1 mL/h的通量（见引用链接），VIRRION体系具有更高的通量，以满足临床样本的需求。

图1 VIRRION平台内部具有精准可控的碳纳米管阵列结构，用于通过尺寸捕获样品中的病毒。毫米级的芯片通道可以保证在处理样品时具有足够的通量

        VIRRION平台的设计采用微米、纳米两个尺度上的富集方法。首先，利用鱼骨型阵列构建微米尺度的湍流系统，实现微通道内高效的液体混合效率；其次，以可控的氮掺杂碳纳米管阵列参杂金纳米粒子实现鱼骨型通道的组装，在病毒尺度上实现不同病毒颗粒的富集及无标记拉曼检测（掺杂金纳米粒子，以增强拉曼信号）；利用铁催化剂对碳纳米管生长过程的影响，实现不同间隙的碳纳米管的组装（间隙尺寸从22 ± 5 到 720 ± 64 nm可控）。

图 2 压印的方法制作VIRRION及不同内部间隙的碳纳米管阵列

[结果验证]  

1、捕获验证作者首先使用不同尺寸的荧光纳米粒子验证平台对纳米粒子的捕获效率。在设置的三个捕获区域内，作者分别对400，140，25 nm的微粒进行捕获。在500 uL/min的流速下，可以达到34.3 ± 4.5 %的捕获效率。而在模拟手推注射器4 mL/min的流速下，该平台依旧有22 %的捕获效率。由于样品排出后可以回收，将回收样品再次注入平台内，可以使得回收效率进一步提高。在经过四次重新注入的情况下，纳米粒子的捕获效率可以达到40%。这些表明了该平台在不同流速下，对不同尺寸的纳米粒子可以很好的进行分离和捕获。

图3 不同纳米荧光粒子在芯片内被捕获。纳米粒子按照其尺寸，在相对应的区域所捕获，从而达到分离不同尺寸纳米粒子的作用

2、鉴定平台及活性分析

作者为了验证该平台对病毒的鉴定能力，使用3种病毒建立了拉曼光谱数据库，每种病毒采样100个点作为指纹库。每种病毒在10²/mL的浓度下可以实现很好的区分。10²/mL的检测灵敏度，接近RT-PCR。作者结合主成分分析方法（principal-component analysis, PCA)及交叉学习的机器算法实现了病毒的聚类分析，准确度达到72%。作者通过对两种禽流感病毒在富集前后的测序分析，结果显示VIRRION平台可以完整的保留病毒的基因组学信息。并且，通过富集，大大提高到了数据中病毒的含量，降低了宿主信息，进一步提高病毒鉴定的分辨率。

图4  三种病毒建立拉曼数据库及病毒聚类分析

3、临床样本分析

作者使用临床中的鼻拭子进行三种不同病毒的捕获与识别，通过对芯片不同位置进行电镜观察，可以看到三种病毒都可以很好的在相应区域被捕获到。使用拉曼光谱对不同病毒进行鉴定，可以清楚地区分三种病毒。使用机器学习的算法，实现了93 %的病毒识别。通过测序分析，三种病毒在测序数据中富集近10倍，并且病毒的基因覆盖率得到大幅的提升。相比于传统方法，该平台可以在3分钟内实现临床样本的病毒捕获和识别。

图5 临床样品中三种病毒的鉴定

[总结]

文章研究思路清晰，数据翔实，实际样品验证完善。该文章沿用该组所擅长的碳纳米管阵列，结合微流控技术，将其应用在病毒检测这一热门领域，加之一些机器学习的内容，使得文章比较丰满。内容具有一定开拓性和创新性。该文章没有涉及如何解决病毒的释放问题，只能通过整体回收的方法对富集的病毒基因组回收。这使得其分析结果只是一个整体性的分析。如果解决了这个问题，我们认为还可以进一步充分发挥可控的孔间隙所带来的分区优势。病毒的富集和鉴定是传染病研究领域的重要突破口，微流控技术的高通量、自动化等优势，将给病毒分析领域带来全新的应用分析，我们期待更多的新技术被开发用于传染病领域的检测。

撰稿人：Lxer and Jienan Shen （李星锐，沈杰男）

编辑：面面

原文链接：

https://www.pnas.org/content/117/2/895.short 

部分参考文献：

1.     Y.-T. Yeh et al., Tunable and label-free virus enrichment for ultrasensitive virus detection using carbon nanotube arrays. Sci. Adv. 2, e1601026 (2016)

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