微流控技术在液体活检领域的应用
随着肿瘤早期诊断及个体化治疗理念的提出与发展，人们对肿瘤研究不断深入，逐渐意识到在肿瘤诊治方面，传统肿瘤组织活检具有一定的局限性，而液体活检作为一种新型的获取肿瘤信息的方式，已引起人们的极大关注。目前，用于液体活检分析的工具很多，基于微流控技术分离和纯化特异性循环肿瘤生物标志物的平台具有通量高、灵敏度高、消耗量低、敏感度高、自动化程度高以及可控性强等特点，可作为新型有效的肿瘤诊断和预后工具。本文中，我们将集中阐述液体活检的研究对象：循环肿瘤细胞（CTCs）、外泌体（Exosomes）和循环核酸（cNAs），并讨论微流控技术在分离和纯化肿瘤生物标志物中的重要应用。
1.液体活检背景介绍
近年来，肿瘤诊疗技术已取得很大进步，但是癌症依然是导致人类死亡的主要因素。癌症转移是造成癌症患者死亡的重要因素，同时转移过程相对复杂，增加了癌症诊疗的困难。因此，对于癌症，做到早期诊断、实时监测和准确预后是非常关键的。
目前，传统的组织活检方式存在很多问题，如：成本高、取样难、创伤大等，且难以做到“早筛查、早治疗”。随着生物技术、分子技术和纳米技术的发展，一系列新型技术被应用到癌症的诊疗中。液体活检作为体外诊断的前沿领域，涵盖非侵入式取样，检测肿瘤或转移灶释放到血液中的循环肿瘤生物标志物（CTCs、Exosomes和cNAs），为监测肿瘤动态及个体化治疗提供新的方式，受到人们的关注（图1）。
图1：癌症的形成（A）、转移（B）及循环肿瘤标志物的特点（C）
2.微流控技术的应用分析液体活检背景介绍
①微流控技术概述
微流控技术是一种在微米尺寸级别下处理或操纵液体的技术手段，将混合器、执行器、反应器、分离器、传感器等集于一体，从而优化检测过程。其涉及到电子、机械、化学、物理和生物等多门学科，具有通量高、灵敏度高、样本分析时间短、样本量少、可控性强等优势，被广泛应用于现代分析化学、药剂学、细胞生物学、遗传学等诸多研究领域。也正是基于以上多种优势，微流控技术为探索液体活检中的循环肿瘤生物标志物检测打开通道，为癌症的早期诊断与治疗提供新的有效手段。
②应用分类介绍
1) 循环肿瘤细胞（CTCs）检测
循环肿瘤细胞（CTCs）是指从原发肿瘤或者转移灶的边缘脱落进入癌症患者外周血循环的肿瘤细胞，其不仅携带了肿瘤细胞的全部基因组并且在癌症病变早期就已经存在于外周血循环中，因此CTCs被作为癌症研究的重要对象和癌症早期诊断、疗效评估的重要标志物，可实现实时非侵入式的监控癌症的发展变化及治疗效果。
近年来，CTCs的分离与纯化技术不断发展，但由于CTCs的肿瘤异质性及稀有性（每107-109个血液细胞中仅有1-10个CTCs），分离与纯化CTCs面临巨大挑战。微流控技术平台因其集成度高、设计灵活、材料通用性强和自动化程度高，被广泛应用于CTCs的分离纯化中。
目前，基于微流控技术分离CTCs的方法大致分为两大类：无标签技术和免疫亲和技术（图2）。前者是建立在物理性质基础上分离目标细胞，如大小，密度，形状，变形性和介电性能，而后者主要利用靶细胞的生化特性，通过细胞表面特异性表达的蛋白质生物标志物（主要分为anti-EpCAM正向捕获法与anti-CD45负向富集法）分离靶细胞（图2）。
图2：微流控系统分离CTCs的方法
基于免疫磁珠分离富集CTCs是最常用的方法，具有高灵敏度和高特异性。美晶医疗自主研发的基于微流控技术的CTCs检测平台CellRichTM，可以通过癌细胞表面抗原和共轭偶联到磁珠上的抗体间的相互作用，高效富集CTCs。当血液流经该微流体装置时，其他血细胞在流体力学的作用下被分离出去，与免疫磁珠结合的细胞会在磁场的作用下发生偏转进入分离富集通道，以此达到对循环肿瘤细胞分离捕获的目的。此法与传统的物理分离方法相比，具有较高的回收率与纯化度(图3）。
图3：基于免疫磁珠分离CTCs的微流控系统
2) 外泌体检测
循环肿瘤外泌体是指由肿瘤细胞分泌的具有生物活性的囊泡小体，直径为20-300nm。不同来源的外泌体含有其独特的脂质、RNA、DNA和蛋白质等，可直接反映细胞的来源及进展。外泌体广泛存在于人体体液中，具有很高的丰度（每毫升血液中含有109-1012个外泌体）。因此对肿瘤来源外泌体的检测和分析可以作为无创探究肿瘤来源与进展，进而辅助肿瘤的早期诊断和指导肿瘤治疗。
近年来，外泌体作为肿瘤生物标志物成为无创活检（液体活检）的研究热点，但外泌体分泌是一种动态的过程，其在体液中实时变化，且在肿瘤治疗过程中也存在稳定性问题。因此，精确分离和分析外泌体仍然面临巨大挑战性。与传统的外泌体分离技术如超速离心法，密度梯度离心法等相比，微流控技术在检测自动化、集成能力、消耗时间、产物完整性、纯度、回收率等方面具有很大优势，进而有利于外泌体的下游分析应用。
目前，基于微流控技术分离纯化外泌体的方法主要分为两大类：囊泡大小（20-300nm）和表面生物标志物（如EpCAM、CD9、CD63、CD81），且各有特点。前者建立在纳米多孔结构的基础上，实现快速高效捕获外泌体，但因外泌体的尺寸范围在纳米级别，因此对技术要求较高，且可能受到饱和限制；后者利用免疫亲和原理，建立的微流控系统有抗体修饰微通道或免疫磁珠法（图4），具有高通量、高灵敏度，然而外泌体也具有与CTCs类似的异质性，对于特定生物标志物低表达的外泌体捕获效率不高。
图4：基于免疫亲和原理分析外泌体的微流控系统
另外，对于外泌体的研究虽发展迅速，但与CTCs相比，市场上缺乏成熟的微流控检测系统，在液体活检领域，外泌体的研究应用没有CTCs广泛和成熟。因此，为了更精准的定量和定性分析肿瘤来源外泌体，深入探究外泌体的物理与生物特性，设计结合多个功能于一体的新型微流控系统，对于分离分析外泌体是至关重要的。
3) cNAs检测
循环核酸(cNAs)是指血液循环系统中发现的DNA和RNA片段。可以通过非侵入性手段获取cNAs，用于分析肿瘤的遗传信息及表观遗传信息。基因表达谱与肿瘤的发展及进展显著相关。因此，cNAs作为液体活检重要的生物标志物，可用于癌症的早期诊断和疗效评估。
鉴于现在检测技术不成熟，限制了肿瘤标志物cNAs的临床应用。传统提取分析核酸的方法，如电泳结合荧光染色技术，有一定的局限性，劳动密集型和高成本，且分步操作容易导致样品损失。微流控系统集多种技术于一体，一个设备可顺序执行多个操作，如样品制备，反应，分离，纯化和分析，减少样本损失，提高样本纯度。
因此，新型微流控系统可作为科研人员研究循环生物标志物的重要手段，亦是检测肿瘤生物标志物的未来发展方向。但是，目前用于cNAs检测的微流控系统，依然存在待解决的难题：a)常规提取核酸的过程是分步完成的，不能保证核酸片段的完整性，易导致分析错误，需要开发柔和、简便、快捷的提取核酸方法，从而充分发挥基因图谱分析及分子测序技术的强大功能。b)传统的微流控系统只是单纯的分离系统， cNAs分析，需借助qPCR，数字PCR和测序平台等，而PCR方法有其内在的限制，如扩增错误，重复性差和扩增效率不同。
图5：分析cNAs的微流控系统
另外，遗传突变在不同肿瘤中的概况远比我们所能想象的要复杂，存在严重的肿瘤异质性，使得通过解析cNAs辅助癌症诊疗更加艰难。这要求优化现有微流控系统性能，结合基因特性，开发更多高精准、高效率、高集成度的微流控系统，从而更好地服务于液体活检的临床应用。
3.结语
液体活检作为一种新型的非侵入性的样本获取方法，为癌症诊断与治疗提供新的方式。微流控技术因其具有高度集成化及时空操控性强等优势，为液体活检提供重要平台，并吸引了科学界和生物技术产业界的极大关注。
与此同时，在临床肿瘤诊疗的转化应用上，肿瘤液体活检依然面临重重挑战：
a)这三种肿瘤生物标志物的含量及其稀少，且存在肿瘤异质性，使得对其分离和纯化非常困难。克服这一挑战，需要开发充分利用肿瘤生物标志物的物理学与生物学特性相结合的微流控平台。
b)高精准度、全自动化的基于微流控分离、纯化肿瘤生物标志物的系统多处于科研阶段，未被临床广泛应用。
c)循环肿瘤生物标志物与微流控平台之前的关系尚需完善，为进一步推动灵敏度高、重复性好的微流控系统的开发，需在多种癌症患者中进行大量的临床试验。
d)我们对肿瘤生物学的理解仍处于起步阶段。随着不断深入研究各种循环肿瘤生物标志物在肿瘤形成和发展中的作用，更强大、更有效的商业化微流控系统将应运而生。
相信，未来，在肿瘤液体活检及个体化诊疗领域，微流控技术将会发挥越来越重要的作用。
原文：
Nanjing Hao and John X.J. Zhang . Microfluidic Screening of Circulating Tumor Biomarkers toward Liquid Biopsy Separation & Purification Reviews, Separation & Purification Reviews, 2017.
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