微流控芯片电泳分离血清高密度脂蛋白亚类的研究

高密度脂蛋白(HDL)是一种由脂质和蛋白质构成的，在形状、密度、颗粒大小、电荷和理化特性等方面都具有较大异质性的脂蛋白，它参与胆固醇逆运转，具有抗动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)作用。HDL亚类成分可以作为评估AS的危险因素，与冠心病(CHD)密切相关，但对于亚类HDL2和HDL3的相对重要性问题在临床上一直存在分歧，国际上仍未得到统一认识，其中一重要原因是因为缺乏简易、准确的HDL亚类分析方法。

微流控芯片电泳能够快速高效分离分析DNA、氨基酸、蛋白质、细胞等，分离效率高、重复性好。本研究利用自制的石英芯片结合激光诱导荧光(LIF)检测系统，在本研究组前期研究基础上进一步改良，可简便、高效分离出HDL亚类，并对健康体检者和CHD患者血清标本进行分析，初步探讨了微流控芯片电泳用于HDL亚类分析的临床应用价值。

1材料和方法

1.1 标本来源

南通大学附属医院经冠状动脉造影证实的CHD患者、排除心脑血管疾病及其他影响血脂代谢疾病的健康体检者。

1.2 试剂与仪器

1.2.1 试剂。浓度为15.5g/L的HDL标准品、Tricine、甲基葡胺(MEG)、十二烷基硫酸钠(SDS)、乙二醇、甲醇、磷钨酸PTA)、氯化镁(MgCl2)、溴化钾(KBr)；硝基苯并噁二唑-C6-酰基鞘胺醇(NBDC6-ceramide)；沉淀剂按照中华医学会检验学分会推荐的PTA-Mg沉淀法中描述配制(1.52mmol/LPTA、0.05mol/LMgCl2，pH6.1)；样品缓冲液由40mmol/LTricine、50mmol/LMEG、0.2mmol/LSDS(pH8.5)组成；分离缓冲液由40mmol/LTricine、50mmol/LMEG、0.01mmol/LSDS(pH8.5)组成。所用试剂均为分析纯，配制试剂用水为二次蒸馏水，试剂配置好后均用0.22滋m的滤膜过滤。

1.2.2 仪器。LIF检测系统(自行研制)；OptimaTML-90K型超速离心机；7600-020全自动生化分析仪；CX系统电源(0～5000V)。

1.2.3 自制芯片。石英玻璃经光刻、湿法腐蚀、高温键合而成，结构见图1。整个芯片大小为64mm伊32mm,芯片微管道宽100滋m,深约25滋m,芯片样品池到十字交叉点长4mm，有效分离长度为42mm，储液池的直径为2mm。样品池1和样品废液池2间通道用于进样，缓冲液池3和缓冲液废液池4间通道用于电泳分离。

Fig.1Structureforthemicrochip(a)Chip.(b)TheSEMphotographforthecross-pointchannel.1:Samplereservoir;2:Samplewasterreservoir;3:Bufferreservoir;4:Bufferwasterreservoir.

1.3 方法

1.3.1 标本准备。受试者素食3天后，清晨空腹采血3ml，以3000r/min离心10min后分离血清，所取血清标本加入同体积沉淀剂，充分混匀，置室温15min后3000r/min离心15min，离心后吸出上清液供测定。要求4h之内完成分离检测，或-70℃保存。HDL标准品预处理过程：1滋lHDL标准品加入10滋l去离子水，再加入4滋l0.2g/LNBDC6-ceramide(以v(乙二醇)∶v(甲醇)=9∶1混合液预先溶解)避光预染1min，最后加入60滋l样品缓冲液。血清标本预处理过程：6滋l预测血清加入2滋l去离子水，再加入4滋l0.2g/LNBDC6-ceramide避光预染1min，最后加入20滋l样品缓冲液。

1.3.2 电泳过程。在芯片样品废液池、缓冲液池、缓冲液废液池中加入分离缓冲液，并使通道内充满分离缓冲液。在样品池中加入样品，使激光束聚焦于芯片分离通道下检测点处。按下列程序分别向4个储液池施加电压，进行进样和分离操作：进样45s，样品池、样品废液池、缓冲液池、缓冲液废液池分别施加760V、0V、300V和450V电压；分离4min，样品池、样品废液池、缓冲液池、缓冲液废液池分别施加500V、500V、3500V和0V电压。运行温度25℃，分离电场强度为450V/cm.

1.3.3 电泳原理。石英芯片微通道表面在缓冲液是碱性的情况下，硅羟基解离产生负电荷，缓冲液中阳离子在芯片管壁负电荷表面形成一圆筒形的阳离子鞘，在外加电场作用下，携带溶剂一齐向阴极迁移，便形成电渗流。管道中HDL亚类的迁移速度是外加电场、溶剂阻力与电渗流作用的结果，由于电渗流的作用通常大于带电粒子所受电场力作用，所以样品粒子在管道进行与电渗流方向一致的差速迁移。最后通过末端检测器的检测并记录得到电泳图谱。

1.3.4 统计分析。采用SPSS11.0软件进行统计学处理，数据用x依s表达。组间差异比较使用方差分析，P<0.05有显著性差异。

2结果

2.1HDL亚类的峰型鉴定

HDL标准品的电泳图谱见图2，HDL被分为2个区带(a，b区带)，其出峰时间分别为1.5min和1.8min，4min内完成分离。根据Havel等[10]报道的超速离心法制备HDL2和HDL3，HDL2加入到分析样品中b区带明显增高、面积增大，见图3；HDL3加入到分析样品中a区带明显增宽、面积增大，见图4。可以判定快速迁移峰a为HDL3，慢速迁移峰b为HDL2。

2.2沉淀剂处理前后血脂水平的测定

表1为随机选取一健康体检者血清标本，生化分析仪测得的沉淀剂处理前后血脂水平。沉淀剂处理后血清被2倍稀释，所以处理后测得指标乘以2。

Fig.2EletropherogramoftheseparationofstandardHDLTheinjectionconcentrationofHDLwas80滋mol/L.Separationconditions:Samplebuffersolutioncontained0.2mmol/LSDS,40mmol/LTricine,50mmol/LMEGatpH8.5.Separationbuffersolutioncontained0.01mmol/LSDS,40mmol/LTricine,50mmol/LMEGatpH8.5,withEat450V/cm.

Fig.3EletropherogramofthemixturesofstandardHDLand2滋gHDL2SeparationconditionswerethesameasdescribedinFigure2.

Fig.4EletropherogramofthemixturesofstandardHDLand2滋gHDL3SeparationconditionswerethesameasdescribedinFigure2.

Table1Theserumlipidlevelsofhealthysubjectsbeforeandaftertheserumtreatedbyprecipitatingagent

2.3临床血清HDL的分析

图5、图6分别为健康体检者和CHD患者血清标本连续3次电泳分离结果。全自动生化分析仪测得HDL-C浓度分别为1.78mmol/L和0.56mmol/L.

Fig.5EletropherogramsofthehealthysubjectanditsreproducibilitySeparationconditionswerethesameasdescribedinFigure2.

Fig.6EletropherogramsofthepatientwithCHDanditsreproducibilitySeparationconditionswerethesameasdescribedinFigure2.

2.4CHD患者与健康体检者HDL亚类的峰面积

表2为受试标本HDL2、HDL3峰面积的统计学结果，可见CHD患者HDL2(P<0.001)峰面积显著低于健康体检者组，CHD患者HDL3(P<0.001)峰面积显著高于健康体检者组,提示CHD患者HDL2有减少趋势，HDL3有增多趋势。

Table2PeakareaofserumHDLsubclasses

3讨论

微流控芯片电泳可方便实现小体积(nl)进样、分离等操作，还可在分离时施加常规毛细管电泳难以达到的高场强，能达到快速、高效分离。微流控芯片电泳用于血清脂蛋白的分离分析是由Weiller等于2002年首次报道的，本研究组前期也有过基于微流控芯片电泳技术，利用自制的微芯片结合LIF检测系统3min内分离血清HDL、低密度脂蛋白和极低密度脂蛋白[6]的相关报道，重复性和稳定性均较好。

HDL是由脂质(磷脂和游离胆固醇位于颗粒表面，胆固醇酯和三酰甘油位于核心)和蛋白质(载脂蛋白和多种少量其他蛋白质)组成的复杂大分子.HDL不同亚类可以根据其密度、颗粒大小、电荷及组成不同进行分离，分析方法主要有超速离心法、梯度凝胶电泳法、质子核磁共振光谱法、免疫亲和层析法、双向电泳-免疫印迹法等，但这些方法多半费时耗力，技术要求高，无法在临床上推广应用。

本研究主要以微流控芯片电泳技术为平台，结合LIF检测系统，构建检测血清HDL亚类的方法。研究中首先优化了实验条件。Tricine、MEG缓冲液具有较宽的pH范围，在电泳过程中能够保持稳定的电渗流，使结果具有良好的重复性。MEG还具有动态涂层作用，能部分消除管壁对蛋白质的吸附。我们考察了MEG浓度对实验结果的影响，最后发现MEG浓度为50mmol/L，Tricine浓度为40mmol/L时，HDL得到了最佳分离效果。脂蛋白颗粒在碱性溶液中带负电荷，电泳过程中，荷质比不同的脂蛋白组分在电渗流的驱动下实现分离，在极端pH时有利于电渗流，但同时极端pH易使蛋白质变性，影响检测结果。我们对缓冲液pH进行优化，分别考察了pH值为7.8、8.0、8.2、8.5、8.8、9.2、9.8时HDL亚类的分离效果。最后发现，pH为8.5时，HDL分离效率最高。蛋白质吸附会严重影响分离效率和重复性，SDS是一种阴离子型表面活性剂，Ceriotti等[12]通过激光散射分析实验证实，样品溶液中存在低浓度的SDS时不会引起脂蛋白颗粒结构的改变，我们分别在样品缓冲液和分离缓冲液中添加了0.2mmol/L和0.01mmol/LSDS，有效提高了分离效率和分离度。

实验中使用的沉淀剂按照中华医学会检验学分会推荐的PTA-Mg沉淀法中描述配制，原理是利用沉淀剂中大分子多阴离子化合物(磷钨酸盐)与两价阳离子(镁离子)沉淀血清中乳糜微粒、低密度脂蛋白、极低密度脂蛋白和脂蛋白(a)，离心后上清液中只含有HDL一种脂蛋白。由表1可知，代表Table2PeakareaofserumHDLsubclassesCHD(n=18)Healthysubject(n=23)HDL20.285依0.039*0.552依0.096HDL31.394依0.091*1.108依0.074HDL3HDL2HDL3HDL2HDL3HDL20.30.60.91.21.51.82.12.42.73.03.33.63.9t/min0.0伊1000··221生物化学与生物物理进展Prog.Biochem.Biophys.2010;37(2)HDL的指标HDL-C和载脂蛋白A1在沉淀剂处理前后几乎不变，而代表低密度脂蛋白、极低密度脂蛋白和脂蛋白(a)的另3个指标都近似0，由此断定离心后上清液中只含有HDL一种脂蛋白。本实验中使用的荧光染料NBDC6-ceramide是一种能与脂蛋白颗粒特异性结合的染料，不受血清中其他物质干扰。

图5、图6分别为健康体检者和CHD患者血清HDL连续3次进样电泳图谱，HDL3和HDL2峰均得到基线分离，且重现性良好，图5、图6中HDL2峰的出峰时间和峰面积相对标准偏差分别为2.76%、2.92%和2.85%、2.93%，HDL3峰的出峰时间和峰面积相对标准偏差分别为2.15%、2.24%和2.17%、2.31%。表2为18例CHD患者血清标本和23例健康体检者血清标本的HDL亚类峰面积统计结果。可见，CHD患者HDL2显著降低(P<0.01)，HDL3显著升高(P<0.01)，可能是因为CHD患者逆向转运胆固醇的能力降低，新生的HDL3较难转变为成熟的HDL。在后续实验中，我们将进一步优化方法学，并选择合适的内标，争取快速简便完成定量测定。

综上所述，本研究以微流控芯片电泳技术为平台，结合LIF检测系统，HDL亚类在4min内达到高效分离，重复性较佳，测试费用低廉，弥补了传统检测方法费时、繁琐等不足，具有较大的推广价值。

文献来源生物化学与生物物理进展DOI:10.3724/SP.J.1206.2009.00506作者：郑慧斐丛辉王惠民（转载仅供参考学习及传递有用信息，版权归原作者所有，如侵犯权益，请联系删除）