使用微流控装置固定化线虫

秀丽隐杆线虫通常缩写为  线虫， 是一种非寄生线虫，由于其特殊的属性，它被广泛用作生物学中的模式生物。线虫的神经系统一直是科研工作者调查的主题，因为它是最简单的有机体之一。这种兴趣使  秀丽隐杆线虫  成为第一个将其全基因组测序的多细胞生物体。这些特点使  C. elegans  成为生物学家在活细胞成像领域的选择。

为了实现秀丽隐杆线虫的高分辨率，活细胞视频和图像而实现的最重要的先决条件 是动物的固定化。事实上，偶然运动可能会引起文失焦图像，使整个观察无用。固定化方法可以分为两种通用方法：化学技术和物理技术。

第一类包括通过任何化学化合物（如金属离子或抗体）实现固定的所有方法。虽然这些技术可以在固定化方面提供良好的结果，但它们中的大多数似乎对细胞有不利影响，即使使用非常低的浓度。另一方面，物理技术通常取决于介质的粘度通过捕捉和保持蜗杆的某些方式或一些手段来改变。在Aufderheide（2008）中可以找到更详细和详尽的这些方法的综述。

关于  秀丽隐杆线虫，在文献中蠕虫固定的最常用技术依赖于使用胶水或麻醉药物。虽然这些方法已经很成熟，但它们可能会影响样本诱导生理变化或阻止未来的操作。此外，它们是低通量技术，因为用这些方法固定大量线虫相当困难和耗时。即使使用更新和更复杂的手段来获得  线虫 固定化，如聚苯乙烯纳米粒子（Kim  et al。，2013），而设置起来更容易有缺陷。最严重的缺点是，固定化依赖于蠕虫生长阶段，因此需要预测蠕虫的种群。

微流控技术 可以解决与线虫研究有关的固定化和其他问题 ，因为它不仅可以控制流体流动和药物输送  到样本，还可以为动物易于操作和处理提供平台。此外，避免使用胶水和麻醉剂进行需要蠕虫固定的研究。

近年来，为了获得片上蠕虫固定，已经开发了许多微流控中的方法和装置。最显着的是通过冷却（K. Chung  et al。，2008），压缩或限制（TV Chokshi  等人，2009; SE Hulme  等人，2007），CO2（TV Chokshi  等人，2009）和周围流体的凝胶化（J.Krajniak和Lu，2010）。

1.微流控温度诱导 秀丽隐杆线虫的固定

Kwanghun Chung（K. Chung 等，2008）开发的这种方法  解决了体内  显微镜，表型和筛选的关键挑战  ，即具有能够以与标准读数兼容的方式处理蠕虫的硬件，并且允许自动化观察和操作样品。在这项技术中，它采用了 内置阀门的聚二甲基硅氧烷（PDMS）微流控芯片控制线虫的悬浮。该设备的关键特征在于集成了几项关键设计特性，确保实验具有高通量。另外，可以采用一种算法来自动完成图像采集，分析和分类的整个过程，从而使系统无需人工干预即可运行。Chung的方案依靠4个步骤（图1）：蠕虫首先通过恒定的压力驱动流动（恒压泵）加载到微流体装置中，然后通过冷却可逆地固定样品，并由高分辨率显微镜扫描。随后，进行表型分型并将获得的视频/图像存储用于进一步分析。

所述微流控芯片  是通过常规的软光刻方法制造。它由两层组成，一个用于流量调节，一个用于温度控制，由一个20μm厚的PDMS膜分开（图2）。这些层通过等离子体处理结合在一起并覆盖玻璃板。微流体装置的特征在于六个显着特征：

图2

1.  内置系统可自动调节芯片内的线虫负载，确保成像室内一次只有一个蠕虫。

2.  一个定位系统，可以高精度地将每只动物放置在同一个位置。

3.  温度控制系统，其提供所需的样品的固定的冷却。

4.  装置与任何标准显微镜设备完全兼容。

5.  低成本和相对容易的制造。

6.  高吞吐量和分拣效率。

为了将蠕虫加载到芯片中，两个出口通道都关闭，而侧面定位通道保持打开。然后通过恒压泵将流体驱入通道。此外，加载调节器系统确保一次只有一个蠕虫在指定用于成像的芯片区域中。这是可能的，因为当动物存在于成像室中时，室的流动阻力增加。流量压力 - 降低位于成像室入口处的样品加载调节器上的第二只动物的压力。因此，这种压降使系统无法将第二个蜗杆推入其中。然后，当第一个蠕虫被释放时，这个限制被解除，并且压力回升到系统能够推动连续蠕虫内部的点。为了实现成像室内精确和可重现的定位，利用定位通道与主通道入口之间的压力差。事实上，一旦动物定位在检测区域内，定位通道的流体动力学阻力就自动均衡，并且因此压力均匀地分布在蜗杆的主体上，防止对动物造成过高的机械压力。该系统的高精度放置功能可以最大限度地减少显微镜电动载物台的移动距离，从而确定蠕虫的位置，从而使整个过程更加省时。一旦放入成像区域，线虫被冷却至?4°C以固定它们。该程序不使用任何麻醉剂，因此不会因药物使用而对样品产生任何潜在的副作用。此外，已被证明与叠氮化钠固定效果相同。最后，使用微流控技术可以使该设置轻松便宜地进行复制，并与任何标准显微镜设置完全兼容。

2.  线虫 在微流控芯片上的二氧化碳固定化

TVChokshi  等。 （2009）开发了一种线虫 技术 它利用微流体芯片的优势，内置固定室，蜗杆通过创建CO2微环境而被捕获。事实上，二氧化碳能够长时间抑制线虫的运动（长达2小时），而不会对蠕虫造成任何永久性损害，确实在固定后可以恢复几秒钟。此外，这种方法已被证明适用于不同年龄组的蠕虫（L4）。使用的装置是一个双层PDMS微流控芯片（图3）：一层称为“行为”模块，被固定化后的动物恢复活力，另一层为蠕虫被固定的位置，因此被命名为固定化模块。行为模块由一个锯状微通道组成，这个通道迫使蠕虫以正弦形式移动，以便进一步分析它的运动。固定层含有产生二氧化碳微环境的腔室以固定蜗杆，从而可以进行成像。最后，这两层由30微米厚的隔离层PDMS膜。二氧化碳微环境是通过使纯二氧化碳通过控制层并通过膜扩散进入流动层而获得的。众所周知，PDMS对非极性气体具有高度渗透性，因此二氧化碳能够快速替换固定室中的空气。此外，隔膜足够厚以能够维持气体压力（10psi）而没有明显的偏转。

图3

蠕虫被装入芯片的主要流动通道并通过激活集成的微流体阀来操纵（图3中的阀门1,2和3）通过控制通道。垂直于主加载通道的单独通道（“位置”通道）用于将蠕虫定位在行为模块和固定模块内。为了防止蜗杆进入位置通道，一些PDMS支柱（图3，II）在与装载通道的交叉处制造。这种技术可以实现长时间的固定（长达2小时），从而允许更长的时间进行显微镜观察。此外，固定室内氧气的缺乏减少了荧光标记物的光漂白，使得CO 2方法对于长期荧光成像实验（例如细胞发育的延时成像）特别有吸引力。

3. 用于 线虫 诱捕的微流控阵列夹具

S. Elizabeth Hulme  et al。 （2007）设计了一种微流体装置，能够 一次性机械地捕捉大（> 100）数量的  线虫。该程序依赖于在楔形通道（图4）的微流体芯片或“夹子”中的实施，其能够捕获蠕虫并由此物理地抑制其运动。具体而言，微通道的宽度逐渐变窄，从100μm降至10μm，长度为5mm（图4）

图4

该装置本身由一个分配通道网络组成，该分配通道通过驱动动物的恒定压力流动来提供这些夹具的阵列。由于在没有药物治疗或任何其他潜在伤害性措施的情况下进行固定，该方法不会干扰蠕虫的天然生化状态。此外，通过逆转流动的方向，蠕虫从陷阱中释放出来，因此可以对同一群体进行重复采样。 芯片的入口和出口之间需要有恒定的压差才能将蠕虫驱动并捕获到夹具中。必须强调的是一个恒定的压力，重要的是  不 在这种情况下需要一个恒定的流量，因为恒定流动状态导致的压力的无限增加会对固定蠕虫造成严重的机械损伤。图5显示了微流体装置的示意图，该装置基本上由一系列单独的蜗杆夹具组成。通道被设计成可以逐渐卷绕，因此可以适应不同大小的蠕虫，因为即使在同基因群体中，也可以发现个体之间明显的尺寸差异。因此，该系统还可以作为分析设备来测量给定蠕虫种群的大小分布。此外，已经选择了高阶分枝拓扑的分叉，以避免蠕虫在芯片内分布的任何偏差。最后，由于被困蠕虫增加了给定通道的流体阻力，当另一个蠕虫到达同一交叉点时，它不会沿着同一条路径行进; 因此该装置被设计为仅用一个蜗杆加载给定的夹具。但是，重要的是要注意，当蠕虫被固定时，即不能控制蠕虫的方向，也就是说，如果它被头先捕获或尾先捕获。

图5

总结起来，这项技术在相当短的时间内（约15分钟）可以在没有任何化学化合物的情况下可逆地固定大量的线虫。这可以帮助研究人员在实验过程中节省大量时间，并确保在所有观察时间内都能获得高通量。此外，使用微流体装置留下了可能被捕获的线虫数量进一步改善的可能性，并且还实施了添加其他微流体组分的新特征，例如用于药物注射。最后，由于固定装置产生有序蠕虫的阵列，原则上应该可以使用电动显微镜台自动获取数据。

4.  线虫 在微流控芯片上的压缩固定

该技术由Trushal V. Chokshi（TV Chokshi  等，2009）开发，它是前面描述的二氧化碳方法的变体。事实上，该设备的设计几乎完全相同 - 一个双层PDMS芯片 - 唯一的区别在于分隔两层的隔膜。事实上，这次动物的固定是机械地实现的：高压（25psi）的空气流动导致膜在蜗杆上偏转并压缩蜗杆，从而抑制蜗杆的运动（图6）。

图6

为了使固定的效果最大化，进行一些改变以使膜更易变形。首先，使用20：1的PDMS /固化剂混合比率而不是常规的10：1; 这使得PDMS弹性模量减少了两倍。此外，固定模块中微通道的宽度比锯状微通道（90μm）的宽度更宽（110μm），以允许较大的膜偏转。该方法的优点在于制造微流体装置的容易性及其进一步的实施。此外，该技术适用于不同年龄的动物，并且可以以串行方式应用于大量蠕虫以增加吞吐量。

5. 线虫 固定在芯片-凝胶杂化微流体装置

前面描述的方法对于形态学和表型调查是非常有效的，但是存在一些缺点。事实上，它们不允许纵向研究生理活性过程（例如冷却方法）或者由于固定它们所使用的压缩而引起蠕虫解剖特征的变化（例如，夹具和压缩方法）。Jan Krajniak和Hang Lu（2010）针对这些问题设计了一种混合型微流控芯片 - 凝胶系统，该系统可以在生理条件下对特定开发过程进行长期高分辨率成像。特别是该设备能够一次培养，固定和成像线虫。C.线虫的可逆固定化 通过使用生物相容性聚合物：Pluronic F127（PF127）来实现。事实上，这种聚合物能够进行可逆的溶胶 - 凝胶转变，可以通过小的温度变化（?2°C）进行热诱导。特别是，当PF127处于其凝胶状态（凝胶化）时，其粘度增加的水平会抑制动物的任何运动。所采用的微流体装置是基于PDMS的双层芯片（图7），其中两层由薄PDMS膜分开。

图7

一个模块用于加载和流量控制，另一个用于温度控制。两个通道的厚度均为3 mm，而它们之间的隔膜为30μm。芯片的两层用传统的氧等离子体处理结合在一起。该装置的一个关键特征是蠕虫在该装置内培养，因为后者能够为其8个室内的线虫提供营养和气体交换（图8）。

图7

此外，这些室用于在所有调查时间内保持动物分离，从而确保可以在单一动物的基础上进行发育。流层包含所有流入口，这些入口用于加载蠕虫并向腔室供应PF127溶液和各个培养室。此外，使用气动阀门以防止线虫从培养室逃逸。第二层是温度控制模块，它用于在设备上产生小的（几°C）温度变化以触发PF127转换。通过调节流量来实现精确的温度控制的加热流体并保持加热流体源温度。如前所述，所采用的固定机制依赖于PF127的溶液，PF127被导入培养室并进入由热转变触发的可逆溶胶 - 凝胶转变。因此固定在室内的任何地方进行，不依赖于蜗杆布置，并且具有最小的环境变化。总之，该方法能够长时间固定多达8个蠕虫而不干扰其生物学功能，此外，固定方案在完全可逆的情况下可以达到不确定的次数。

结论

  在这篇文章中，已经提出了一些实现C. elegans 固定的最显着的微流控方法  。特别强调了利用微流控技术实现这一目标的明显优势。常规固定方法主要依赖于胶水或麻醉药物，已被证明是耗时，低通量且对样品有害的。现在出现的明显问题是：  我应该选择哪种微流控技术？

这个问题没有特定的答案，哪种技术最适合你，这取决于你的要求和需求。此外，这些方法中的每一种在线虫  固定化方面确保非常好的结果  。无论如何，其中Chokshi的方法提供了最佳的折中方面的制造困难表现。所采用的微流控装置实际上相当简单，因为它是一个双层PDMS芯片与一个简单的通道阵列。此外，如果研究人员要求短时间（分钟）或长时间（小时）固定时间，则可以使用相同的设计用于两种固定技术（压缩和CO2）。此外，这种方法可以应用于不同年龄组的蠕虫，并允许动物完全恢复固定。

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