微流控芯片技术在细胞培养、分选的研究与应用

微流控芯片(microfluidics)又称芯片实验室(labonachip),是将化学和生物等领域所涉及的样品制备、反应、分离和检测等基本操作单元集成到几个平方厘米大小的具有微米级通道结构的芯片上,采用可控流体,完成常规化学和生物实验室的各种功能的一种微技术平台。微流控芯片具有小型化、集成化、高通量、低能耗、分析快速等特性。自20世纪90年代初,微流控芯片以芯片毛细管电泳的形式出现以来,目前已广泛应用于生物、医学、环保和新药研究等领域。

有别于以静态亲和杂交为基础的传统生物芯片,微流控芯片采用微流体控制技术,为动态生物分析提供了一个崭新的技术平台。微流控芯片在生物领域的应用可分为分子水平和细胞水平。细胞是生物体结构和功能的基本单位,一切有机体(除病毒外)都由细胞构成,对细胞的深入研究是揭开生命奥秘和治疗疾病的关键所在。虽然以毛细管电泳和流式细胞仪为代表的细胞分析仪器被普遍应用,但功能单一,而且存在各自的不足。例如,毛细管电泳不易对细胞操控和处理,流式细胞仪耗费大量样品等。微流控芯片在细胞学研究方面具有以下一些优点:第一,微流控芯片通道尺寸(10~100μm)与单个细胞直径(10~20μm)大小相近,便于对细胞进行操控;第二,微流控芯片的多维网络结构形成相对封闭的环境,更接近生理状态下细胞的生存环境;第三,微流控芯片可以满足高通量细胞分析的需要,可同时获取大量的生物学信息;第四,微流控芯片上多种操作单元灵活组合,使得细胞进样、培养、捕获、裂解和分离检测等过程在一块芯片上即可完成;第五,微流控芯片为平板式几何构型,更方便进行观察;第六,芯片上传热和传质快,有利于热量和物质的扩散。由于微流控芯片能在试验条件下模拟生理条件,为在单细胞和多细胞水平更好地研究细胞提供了一个全新的技术平台。本文对近年来微流控芯片在细胞生物学研究中的一些主要应用,包括细胞的培养、分选、裂解、凋亡、计数、迁移、单细胞捕获和细胞间相互作用等进行了综述。

1.细胞培养

细胞培养是细胞生物学、组织工程、生物医学工程和药物开发中的关键步骤。在传统的体外细胞培养中,细胞多为贴壁和二维生长,由于离体后的细胞失去了神经体液的调节和细胞之间的相互作用,而且处于相对静止的环境中,所以细胞除了增殖外并没有像在体内那样发挥其作用,也不能真实反映其在体内的生存情况。微流控芯片和传统的体外细胞培养相比,具有很多优点,诸如:精确控制物质浓度、溶液温度和pH值等细胞微环境要素;提供微小和复杂的结构来模拟细胞在体内的生存环境;提供三维生长环境以模拟细胞在体内的状态,考察细胞的行为(如基因表达、受体作用和其它生命活动)等。在哺乳动物组织中,细胞的生长受到多方面因素的影响,不仅细胞之间存在相互作用,细胞与胞外基质也有密切联系,同时细胞还受到各种自分泌、旁分泌及激素等信号分子的作用。因此建立细胞体外三维培养环境,需要将细胞植入模拟细胞外基质的培养环境中。目前有天然和合成的水凝胶已被成功整合到芯片上,但与此同时也出现一些问题,如操作复杂和阻碍物质的传输。为解决这些问题,Ong等设计了椭圆形微柱阵列的芯片(图1A)。细胞预先用高碘酸钠处理,使其表面的糖蛋白产生醛基,再与培养液中的聚乙烯亚胺酰肼(polyethyleneimine-hydrazide)连接物结合形成三维生长结构,最后,用钙黄绿素和碘化丙啶染色后,观察细胞的生长情况。另外,Huang等设计了一款自动培养细胞的芯片(图1B),通过设置气动微泵和微阀使培养液和缓冲液流入细胞培养区域,同时将代谢废物排出。芯片中的栅栏形微型加热器和温度感应器能提供一个较恒定的温度(37?C±1?C)。羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)缓冲液则为细胞生长提供适宜的pH条件。Nevill等设计制备微流控芯片,将细胞培养和电化学裂解功能结合在一起,对细胞中的蛋白(p53和HRP)进行分析,大大降低了分析时间和成本。在微流控芯片上还可以进行肝、肺细胞和组织培养,构建体外毒理实验模型。除此之外,微流控芯片还可以用于干细胞和癌细胞的培养。由于干细胞生活在复杂的物理、化学和生物因素下,传统的培养方法不能很好地模拟其生理环境,并受到各种限制,而微流控芯片技术可以更好地模拟干细胞在体内复杂的生活环境,以高通量和可变方式精确控制各种参数。癌细胞最大的特点是侵袭和转移,利用微流控芯片可以模拟癌细胞渗入血管、在血管内随血液循环流动、渗出血管和迁移到靶组织等一系列过程。由此可见,采用微流控芯片来培养细胞将成为细胞生物学研究的一个重要手段。

A:非水凝胶3D微流控细胞培养体系包括两个入口(一个是培养基入口,另一个是细胞灌注入口)和一个出口。微坝结构将微流控通道分为中心细胞培养室和两边用来扩散培养基的通道两部分;B:细胞自动培养体系图解说明,此体系由一个细胞培养室,四个微泵、四个微阀、微通道、储液池、两个加热器和一个微型温度传感器组成。

2.细胞分选

细胞分选是从非均一细胞体系中筛选出性质均一细胞的技术,在细胞免疫学和临床诊断中具有非常重要的作用。目前最常用的细胞分选方法有磁珠免疫法和流式细胞仪法,其中磁珠免疫法对细胞表面有特异性要求,而流式细胞仪虽然能对细胞进行快速可靠的分选,但其体积庞大、价格昂贵、难以灭菌。除此之外还需要专业人员操作和复杂的前处理过程,并伴随大量的样本消耗。为了弥补这些缺陷,有报道将流式细胞仪的主要部件与微流控芯片结合起来,从而实现小型化和低成本分选细胞。

目前,以微流控芯片技术为平台的细胞分选方法主要有两种:

(1) 以微结构和层流为基础的被动分选;

(2)以各种外力(如磁力、介电电泳力、电动力等)驱动的主动分选。

2.1以细胞大小为基础的过滤分选

借助微型机电系统(MEMS)技术,Chen等设计和制造的立柱型和堤坝型过滤芯片,依靠平行的微立柱和微坝尺寸大小来分离细胞。图2A所示的聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)芯片利用红细胞与白细胞体积大小的差异将红细胞从大鼠全血中分离出来,在主通道的垂直方向设置了微型堤坝,两者存在5?m的高度差,当缓冲液沿垂直主通道方向灌流时,红细胞被冲到侧面,经过微型堤坝结构流入收集池里。图2B所示芯片在主通道内两侧设计了两排直径20μm、间隔6.5μm的立柱,圆饼状、体积较小的红细胞能通过立柱间的缝隙进入两边的通道,而圆球状的体积较大的白细胞则留在主通道内,从而达到分选效果,与此同时,连续流动的溶液将白细胞冲到出口处,避免微通道发生堵塞。

2.2受介电电泳作用的细胞分选

介电电泳是指本身不带电、但可以发生不同程度极化的颗粒在非均匀的电场中移动的现象。与电泳分离不同,介电电泳不是依靠粒子的荷质比,而是依据不同介电性质对颗粒进行分离。当处于非均匀电场时,细胞产生极化现象,其表面会发生偶极矩作用,进而细胞在介电电泳力作用下,向高场强(正向介电电泳)或低场强(负向介电电泳)方向移动。由于细胞的大小、形状、介电性质不同,细胞所受介电电泳力的大小和方向也不尽相同,因此可对细胞进行分选。

以微流控芯片介电电泳为基础的分选技术具有很多优点:

(1) 所需技术成本低;

(2) 不需要对细胞表面进行修饰;

(3) 操作简便;

(4) 特异性高等。

基于以上优点,在微流控芯片上进行介电电泳已被广泛应用于细胞分选。Nascimento等利用芯片介电电泳对受寄生虫侵染和未被侵染的红细胞进行分选。当红细胞受到侵染后,其细胞膜的结构和表面抗原会发生变化,细胞膜通透性提高,使两种细胞在电场中受力大小和方向不同,导致运动方向发生改变,进而获得分离。为了在芯片上实现介电电泳必须产生非均匀电场,如图2C所示,X型的绝缘结构用于产生非均匀电场,通过改变电压和液体流速,收集HeLa细胞。Pommer等在微流控芯片上设计了两个非均匀电场,对样品中的细胞进行串联介电电泳分离,从全血样品中获得了纯度为95%的血小板。

2.3光驱动的细胞分选

用光作用力进行细胞分选主要有荧光激发和光镊两种形式。荧光激发的细胞分选是将目标细胞预先进行荧光标记,经过检测区域时目标细胞被识别,在激光束作用下使目标细胞进入选择通道。Wang等在微流控芯片上以荧光激发的方式,将被绿色荧光蛋白基因转染的HeLa细胞分选出来,如图2D所示,当样品流经检测区域时,光电二极管检测到细胞的存在,接着光电倍增管对细胞所发荧光进行分析,声光调制器触发光学开关将表达绿色荧光的HeLa细胞送入收集通道。光镊是一种光效应,激光聚集可形成光阱,微小物体受光压而被束缚在光阱处,移动光束使微小物体随光阱移动,借此可在显微镜下对微小物体操控。如图2E所示,在光镊芯片上,细胞样本被数字成像系统检测、识别、追踪,以产生的可控信号为基础,利用激光光镊,目标细胞自动转入邻近的鞘流,最终被分流到下游收集区域。

2.4磁性细胞分选

磁性分选在芯片细胞分选中尤其受欢迎,因为磁力对细胞活力的影响最小。磁性细胞分选的原理是:在目标细胞表面包裹磁性微粒[38]或将磁性纳米颗粒引入细胞内部,从而使其带上磁性标签,当带有磁性标签的细胞流经磁场区域时,磁力使目的细胞偏离原来的运动轨道。由于不同细胞的大小、磁化率、流速不同,细胞偏离原来层流方向的程度不同,从而将细胞分选出来。微流控芯片上的磁性细胞分选可以实现对两种及多种细胞的分选,可以将待分选的细胞用磁性标签标记,其余细胞不做标记,当目标细胞流经磁场区域时运动方向发生改变,从而被分离出来;也可以将多种细胞施加不同磁性标签以达到分选目的。Adams等就在微流控芯片连续层流基础上实现了同时对多种细胞进行空间定位分选,如图2F所示,细胞在进样之前用不同磁性标签标记,流经磁场区域时,不同细胞在磁力和流体驱动力的合力作用下流向不同的收集通道,最后在收集通道将细胞用洗脱液洗脱出来,从而达到细胞分选的目的。

A:用于分选血细胞的PMMA微流控芯片。左图为微流控芯片整体示意图,共有7个口,1:注血口;2-4:缓冲液注入口;5,6:红细胞收集口;7:废液口。右图为分选区域局部放大图;B:用于分选细胞的连续流动微流控芯片。左图为立柱型分选血细胞芯片概略图,a:血液样品注入口,b:白细胞收集口;c:红细胞和血浆收集口;右图为装置末端微立柱阵列扫描电镜图;C:负向介电电泳分离HeLa细胞的微流控芯片;D:荧光激发的微流控芯片细胞分选示意图,细胞流经中心通道时,经过分析转换,靶细胞流向收集口,而其他细胞流入废液口;E:自动化细胞分选系统设计图。当细胞通过兴趣区时,数字图像处理系统产生信号,激发激光光镊,将目的细胞从样品中分离出来;F:多靶标磁性细胞分选结构。样品中含有过量的非目标细胞和2个不同的靶细胞(目标1和目标2),靶细胞分别用特定标签(标签1和标签2)标记,细胞在MFS1和MFS2产生高梯度磁场区域发生分离

微流控芯片技术自20世纪90年代出现以后,随着生物、材料、化学、物理工程和电子工程等学科的介入,目前已取得了巨大的发展,其最终目的是建立多功能芯片实验室。微流控芯片技术正以其独特的优势越来越多地应用到细胞生物学研究中,其不仅可以为细胞提供可控制的生存微环境,与其他分析方法结合检测细胞内生化过程,而且在细胞个体、细胞群体和多细胞生命体三个层次对细胞的生命活动进行深入研究。另一方面,微流控芯片仍处于发展初期,许多方面的技术还不成熟,如不能进行长期细胞培养;细胞三维培养中一些水凝胶和粘连蛋白的引入可能阻塞通道和妨碍物质传输;电裂解细胞时产生的焦耳热和气泡会影响细胞生长和代谢等。目前微流控芯片大多处于实验室概念化论证阶段,尚未达到理想的商业化和通用化程度;对微流控芯片技术了解不多的生物研究人员,应用起来还有一定的困难。但是,基于微流控芯片的突出优点和人们对新技术的需求,我们相信微流控芯片细胞实验室将成为细胞生物学研究的重要平台。

（文章节选自：微流控芯片技术在细胞生物学研究中的应用进展 作者：姚　琳　白亮　吴亮其　丁永胜* 科学网科学网转载仅供参考学习及传递有用信息，版权归原作者所有，如侵犯权益，请联系删除）