微流控芯片荧光检测系统研究进展
自微流控芯片问世以来，检测器研究一直是人们关注的热点。微流控芯片中各种生物和化学过程通常是在微米量级的通道几何结构内完成的，因此，要求其检测器具有灵敏度高、响应速度快、微型化等特点。
荧光检测(FluorescencedetectionFD)技术因具有准确度好、灵敏度高等特点，是目前微流控系统最常用的检测技术之一。微流控芯片的主要研究对象如蛋白质、脱氧核糖核酸及氨基酸等自身带有荧光基团、或者衍生化后可产生荧光均可采用荧光检测技术，检出限达10-14mol·L-1甚至可检测到单个DNA分子液芯波导管的引入使检测系统的性能大有改善。本文就目前微流控芯片荧光检测系统的研究进展进行综述主要介绍用于微流控芯片的激光诱导荧光(LIF)、发光二极管(LED)诱导荧光和其他荧光检测方法和装置以及它们的具体应用。
１荧光检测系统概述
许多化合物如有机胺、维生素、激素、酶等被入射光（即激发光）照射，吸收一定波长的光后，分子中的某些电子从基态向较高能级跃迁，电子之间发生碰撞消耗部分能量而无辐射地降到第一电子激发态的最低振动能级，再回到基态的不同振动能级，同时发射出比吸收光波长更长的荧光。荧光强度与入射光强度、量子效率、样品浓度成正比。
要实现高灵敏度的荧光检测，关键在于降低背景光，特别是激发光背景的影响。因此检测系统的光路结构设计十分重要，目前报道的有正交型、非共焦型、共聚焦型和平行型等（表１）。常用的光学元件包括光源、透镜、滤光片、分色镜、光纤、物镜、光电转换元件等。
由于研究对象和技术方法等实际情况的差异，不同的研究小组在光路的设计、光学元件的配置上各有不同。
表１微流控芯片荧光检测系统的４种光路结构比较
２激光诱导荧光检测系统
激光具有能量高、方向性好、易聚焦等特点，特别适合作为微流控芯片中荧光检测器的光源，以提高检测的灵敏度。激光诱导荧光（ＬａｓｅｒＩｎｄｕｃｅｄＦｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ，ＬＩＦ）检测是目前最灵敏的检测方法之一，其检出限一般在１０－１２～１０－９ｍｏｌ·Ｌ－１之间，最低可达１０－１４ｍｏｌ·Ｌ－１。采用一些改进技术（如光子记数、双光子激发等）对于某些荧光效率高的物质甚至可达单分子检测，ＬＩＦ检测法还具有良好的选择性和较宽的线性范围。早期使用的光源是氩离子激光器，具有功率大、输出稳定、汇聚效果好的优点，但其体积庞大，不利于仪器微型化，已逐渐被半导体激光器取代。半导体激光器功率输出稳定，价格较低、体积较小、寿命长。
单通道芯片ＬＩＦ检测
单通道微流控芯片激光诱导荧光检测器是人们研究最早，也是目前研究较成熟、应用广泛的一类ＬＩＦ检测器，但此类装置大多是研究者自行搭建，缺乏商品化的仪器。Ｏｃｖｉｒｋ等以４８８ｎｍ氩离子激光器为激发光源，采用共聚焦光路以降低背景噪音，在玻璃芯片上对荧光素的检出限分别达到３００ｆｍｏｌ·Ｌ－１（连续流动模式，Ｓ／Ｎ＝６．１）和１ｐｍｏｌ·Ｌ－１（区带电泳模式，Ｓ／Ｎ＝５．８）。林炳承等研制了一种通用型激光诱导荧光微流控芯片分析仪，采用电荷耦合器件（ＣＣＤ）监测通道，三维调节聚焦，发射波长滤光片可方便地更换以适应多种染料选择，以罗丹明６Ｇ荧光试剂作为检测物质，检出限为６．６７×１０－１３ｍｏｌ·Ｌ－１。
通过采用多种方法，可以进一步提高其检测灵敏度。如Ｅｆｆｅｎｈａｕｓｅｒ等通过光子计数技术，对ＰＤＭＳ芯片电泳分离的６０３ｂｐＤＮＡ片段进行检测（ＹＯＹＯ－１标记），检出限达到了１０－２１ｍｏｌ水平。而Ｆｉｓｔｅｒ等采用单光子雪崩二极管（ＳＰＡＤ）作为检测元件，利用双脉冲计数法，对经芯片电泳分离的罗丹明６Ｇ和罗丹明Ｂ的检出限分别达到１．７×１０－１５ｍｏｌ·Ｌ－１和８．５×１０－１５ｍｏｌ·Ｌ－１，分离时间小于３５ｓ，相对迁移时间的不确定性小于２．０％。Ｆｕ等［１７］采用正交型的光路结构，在微流控芯片系统中使用一个简单的ＬＩＦ检测器，从芯片侧壁检测微通道中激发的荧光，以减少来自光源的散射光干扰，从而达到高灵敏度检测的目的。此项研究利用芯片上激光的散射光强度分布的显著差异，接收光信号时避开散射光以达到信噪比（Ｓ／Ｎ）的最大优化。荧光接收角度为４５°时结果最佳，所接收的散射光强度仅为接收角度为９０°时散射光强度的１／３８。以荧光素钠和异硫氰酸荧光素标记的氨基酸为样品进行检测，检出限达１．１×１０－１２ｍｏｌ·Ｌ－１（Ｓ／Ｎ＝３），与优化后的微流控芯片共聚焦ＬＩＦ系统性能相当。
采用半导体激光器作为激发光源，可大大减小ＬＩＦ检测器的体积、重量和功耗，从而适于搭建微型化分析系统。Ｓｈｒｉｎｉｖａｓａｎ等使用波长为６３５ｎｍ的红色半导体激光器作为光源，研制了一种低成本、低功耗的小型荧光检测器，光电二极管加上运算放大器进行信号采集。该系统功率仅２７０ｍＷ，与传统使用氩离子激光器和光电倍增管的检测系统相比，成本减少了９８％，能耗只有传统的１／５０００。在微分析系统中，采用此微型ＬＩＦ检测器进行ＤＮＡ定量分析，误差小于１５％。
多通道阵列芯片ＬＩＦ检测
随着微机电加工技术的发展，人们已经实现在芯片上加工出上百条并行的微通道，进行高通量的反应和分离，以满足药物筛选和基因测序等领域的需求。对阵列微流控芯片进行快速高灵敏度的检测，促进了微流控芯片实验室技术向通量化方向发展。
采用多道扫描荧光检测技术，可以在阵列式微流控芯片上实现高通量、高速度的检测分析。Ｓｈｉ等设计了一种旋转扫描的共聚焦激光诱导荧光四色检测器，用于９６通道圆盘式毛细管阵列电泳芯片分析的检测。检测器的扫描物镜头在步进电极的带动下，依次对芯片上各通道的检测点进行荧光检测，利用共聚焦光路系统将激发光和荧光分开，荧光信号由二个四色检测装置进行检测。该检测器可在１２０ｓ内完成芯片上９６个通道和３８４个通道中ＤＮＡ片段的高通量快速荧光分析，测序速度达到１．７ｋｂｐ·ｍｉｎ－１，比目前商用毛细管阵列电泳测序技术快５倍。该系统适用于低浓度、试剂量少的样品，且在样品的制备处理方面表现出许多优势，有可能成为下一代高性能ＤＮＡ测序平台。
采用电荷耦合器件（ＣＣＤ）作为检测器是多通道阵列芯片的另一种检测方式。Ｓｈｅｎ等采用４７３ｎｍ半导体固体激光器作为光源，激发光束经凹面镜汇聚、柱面镜扩展成一条宽４ｍｍ的线状激光后，滤去杂光聚焦于芯片阵列通道上，激发微通道中的荧光物质产生荧光。发出的荧光经过收集、滤过杂散光后进入ＣＣＤ检测。Ｏｋａｇｂａｒｅ等用波长为６６０ｎｍ的激光作激发光源，电子倍增电荷耦合器件（ＥＭＣＣＤ）转换光电信号，在３０通道的微芯片上进行单分子荧光检测。该检测系统对荧光标记的单个ＤＮＡ分子具有足够的灵敏度，检测速率达到４．０２×１０５个·ｓ－１。将通道变窄，缩短间距，可进一步提高检测速度。ＭｃＫｅｎｎａ等构建了一个高通量细胞计数微流控芯片系统，可在６～１０ｍｉｎ内对３８４份样品进行细胞筛选。Ｇａｒｃｉａ－Ａｌｏｎｓｏ等使用倒置显微镜检测荧光，在８通道的微芯片上进行化合物的毒性筛选。Ｃｈｅｎ等建立了一种快速、超灵敏的检测方法，在５ｍｉｎ内可完成对７－氨基氯硝西泮（７－ＡＣＺＰ）的检测，线性范围为１．１～６０．１μｇ·Ｌ－１，检出限为０．０２１μｇ·Ｌ－１。Ｅｍｏｒｙ等使用ＣＣＤ相机延时合成（ＴＤＩ）模式，对多条微流体通道同时进行单分子的跟踪和检测，可实现每秒１．７×１０７个的高通量检测。
３发光二极管诱导荧光检测系统
在半导体激光器发展的同时，半导体发光二极管（ＬＥＤ）也日益受到重视。ＬＥＤ是一种体积更小，寿命更长、价格更低的发光器件，能极大地简化检测器的结构。目前，多种波长的高亮度ＬＥＤ已上市，利于实现对各种生物样品、金属离子及中药提取物的荧光检测。
为了减少激发光干扰，ＬＥＤ诱导荧光检测系统光路多为正交型。Ｎａｋａｊｉｍａ等采用ＬＥＤ、两个圆柱型透镜、一棱镜及一分色镜、电荷耦合器件（ＣＣＤ）、聚合物芯片等组建了微芯片传感器，实现了低分子物质的在线分析。Ｘｕ等采用共聚焦光路结构，先通过聚合酶链反应（ＰＣＲ），然后在芯片毛细管电泳上用４９０ｎｍ的ＬＥＤ作激发光源，进行双链ＤＮＡ片段一步测定。关亚风等研制了一种ＬＥＤ诱导荧光检测系统，通过柱上检测可与微通道分析系统在线联用，对ＦＩＴＣ标记的苯丙氨酸浓度检出限达１．０×１０－８ｍｏｌ·Ｌ－１。Ｐａｉｓ等使用绿光ＬＥＤ作为光源、两块偏振镜分别过滤激发光与发射荧光，建立了一种高灵敏度的荧光分析方法，对罗丹明６Ｇ和荧光素的检出限分别为０．１μｍｏｌ·Ｌ－１和１０μｍｏｌ·Ｌ－１。
以光纤作为传光介质，能够减小光斑的直径，起汇聚作用。美国哈佛大学Ｗｈｉｔｅｓｉｄｅｓ课题组报道了一种ＰＤＭＳ芯片，该芯片中集成有荧光检测单元，分为三层：通道层靠近分离通道的边缘埋有一根光纤，光纤通过与外部４７３ｎｍ的ＬＥＤ耦合以传输激发光；底层ＰＤＭＳ基片中埋入微型雪崩二极管（μＡＰＤ）作为感光元件，表面覆盖一层ＰＣ聚合物滤光片。该系统对荧光素的检出限为２．５×１０－８ｍｏｌ·Ｌ－１，且被成功地用于蛋白质和小分子混合物的电泳分离和检测。崔大付等在光纤型微流控芯片上建立了用蓝色ＬＥＤ诱导荧光检测系统。ＬＥＤ激发光通过连接在芯片上的光纤传递，到达检测区域，利于实现仪器的微型化，对ＦＩＴＣ的检出限（５Ｓ／Ｎ）达２２ｎｍｏｌ·Ｌ－１。Ｕｃｈｉｙａｍａ等将蓝色ＬＥＤ直接埋入上层聚酯盖片中，在与ＬＥＤ垂直的下层聚酯芯片的通道侧旁固定一多模光纤以收集荧光，将其直接导入光电倍增管中进行检测。
由于光纤纤芯直径（一般为６２．５μｍ）与微流控沟道的深度尺寸（５０～１００μｍ）非常接近，同时用于激发光的传输和荧光信号的采集，提高激发效率和检测灵敏度。Ｄｅｓｔａｎｄａｕ等将刻有Ｙ形通道的ＰＤＭＳ板固定在玻璃基板上，用ＬＥＤ作激发光源，两根光纤分别用于激发光的传导和荧光的收集。对水溶液中钾离子的浓度进行检测，检出限为０．５ｍｍｏｌ·Ｌ－１，且不受钠离子的干扰。Ｉｒａｗａｎ等用蓝色ＬＥＤ、ＰＭＭＡ或石英材料的光纤和小型光电倍增管搭建了一个紧凑型的荧光检测系统，能够检测到磷酸盐缓冲溶液中０．００５ｍｇ·Ｌ－１的荧光素，结果可重复。将该系统应用于多通道检测，对荧光素的检出限达到０．０１ｎｇ·Ｌ－１，重现性良好，相邻通道间未观察到相互干扰的现象。该系统还可应用于芯片上的免疫检测。Ｈｕｏ等用三种不同波长的发光二极管组成阵列作为荧光检测的激发光源，通过光纤束传导激发光，实现了对不同荧光物质的同时检测。
使用液芯波导技术，是提高荧光检测灵敏度的另一种有效方法。Ｄａｓｇｕｐｔａ等最先使用ＴｅｆｌｏｎＡＦ－１６００材料涂覆的毛细管作为液芯波导管，实现毛细管电泳中的荧光检测。Ｗａｎｇ等在微流控芯片上利用ＬＥＤ作为激发光源，结合液芯光纤波导池传输荧光，有效地减小了激发光干扰。以波长４７０ｍｍ的ＬＥＤ为激发光源，用液芯波导Ｈ－通道微芯片与流动注射联用，对ＦＩＴＣ衍生精氨酸的检出限为１．６ｆｍｏｌ，实现了微流控芯片分析系统中的ＬＥＤ－液芯波导诱导荧光检测。在此基础上使用同步双波长调节，提高了检测的信噪比。
光波导元件的芯片集成对提高ＬＩＦ检测单元在微流控芯片上的集成度具有重要意义。通过常规刻蚀手段在平板芯片上形成可定向排列的波导结构，以提高其检测通量和微型光学元件排列的紧凑性。如Ｍｏｇｅｎｓｅｎ等在一块芯片上刻蚀一系列并行的光波导结构，可将一束激光分成１２８道平行光束，而且仅需一个光电倍增管（ＰＭＴ）就可同时检测所有波导通道。他们利用该芯片测定了荧光微粒在微通道中的流速。赵琰等提出了一种液芯波导免疫分析阵列芯片的检测系统，结合光强差技术提高了ＥＬＩＳＡ的灵敏度，辣根过氧化酶（ＨＲＰ）的线性范围为１×１０－１０～９×１０－１０ｇ·Ｌ－１，检出限为３．０×１０－１１ｇ·Ｌ－１，相对标准偏差小于１％，线性范围的下限与检出限均比普通的光度法改善了１００倍，将其应用于血清和尿液中β２－微球蛋白的免疫分析，与标准方法所得结果相符。Ｂｌｉｓｓ等将荧光染料掺入ＰＤＭＳ材料中，通过调节极性控制染料分子的扩散入液芯波导管程度，这些分子选择性地吸收激发光并传送被测样品发出的荧光，以此进行ＤＮＡ片段的分析与检测。
与常规的ＬＩＦ检测器相比，目前，这种集成化荧光检测器的检测灵敏度要低一些，除了ＬＥＤ光强较弱外，还因为所用的ＬＥＤ光源光谱通带较宽，其半带宽通常为２０～３０ｎｍ，导致很难将激发光与荧光有效地分离。Ｒｅｎ等开发了一种新型的便携式荧光检测系统，应用在微流控阵列芯片上。该系统极其简单，使用一个扫描ＬＥＤ光源和一个单点光电传感器，无ＣＣＤ、透镜、光纤或其他活动部件。脉冲驱动ＬＥＤ使灵敏度大大提高，并极大地减少能耗、降低光漂白效应。与传统的毛细管阵列电泳检测系统不同的是，目前该系统能以高扫描率扫描径向的毛细管阵列。用８通道的阵列芯片系统检测ＦＩＴＣ标记的精氨酸试样，检出限可达６４０ａｍｏｌ。
随着微型激光二极管等高质量光源的发展，这种微型化的荧光检测器将对微流控芯片的推广以及最终被公众广泛接受起着十分重要的作用。
４其他荧光检测系统
双光子激发荧光检测的特点是背景散射光的干扰小，信噪比高，由于荧光激发效率平方与入射光强平方成正比关系，探测灵敏体积被限制在焦点附近，更有利于实现单分子探测。Ｚｕｇｅｌ等首次在芯片上实现了双光子激发荧光检测。采用平均功率１２０ｍＷ、发射波长５８０ｎｍ的染料激光器作激发光源，共聚焦的荧光显微镜为光学系统，时间相关的单光子计数器作为荧光检测部件，构成了双光子激发荧光检测器，对荧光素标记的β－萘胺检出限达６．０×１０－８ｍｏｌ·Ｌ－１。Ｓｃｈｕｌｚｅ等使用４２０ｎｍ的激发光，在微流控芯片上实现了对天然蛋白和小分子芳烃的双光子激发荧光检测，检出限达１．０×１０－６ｍｏｌ·Ｌ－１。
Ｄｏｎｇｒｅ等采用直接飞秒激光刻写技术将光学波导管集成到普通石英微流控芯片上，通过光波导管传导连续激光器发出的入射光，对经微流控芯片分离的、带有荧光标记的ＤＮＡ分子进行检测；同一课题组的Ｍａｒｔｉｎｅｚ等采用高数值孔径光纤，以９０°收集激发产生的荧光，通过简单的后处理和规范化的技术将光子功能集成到微流控芯片上。运用先进而独特的三维飞秒激光刻写技术，可实现如分束镜或马赫－贞德干涉仪等更加复杂的功能，该装置结构紧凑、方便携带，克服了目前微流控芯片检测系统检测元件体积较大等缺点。Ｋａｍｅｉ等报道了一种微型集成荧光检测器，对常用的荧光标记染料有较高的灵敏度，适用于即时检测（ＰＯＣＴ）。Ｂｕｎｙ－ａｋｕｌ等以ＳＲＢ作荧光染料，在微芯片荧光检测系统上检测霍乱弧菌毒素Ｂ亚基（ＣＴＢ），检出限为６．６μｇ·Ｌ－１。Ｗｕ等在微芯片上实现了粒子计数与荧光检测同步进行，可以检测到直径０．９μｍ的荧光粒子。Ｓｃｈｕｌｔｚ等报道了一种新型的荧光阵列生物传感检测器，成功地应用于ＤＮＡ杂交分析。
单一的检测方法具有局限性。将荧光检测与其他方法联用进行双重检测，可以得到化合物的更多信息，同时测定不同性质的各种物质，帮助确证峰的归属。Ｌｉｕ等搭建了一种荧光／非接触电导双重检测器。在芯片微通道上进行荧光和非接触电导同点同步检测，对荧光素纳、ＦＩＴＣ和ＦＩＴＣ标记的精氨酸、甘氨酸、苯丙氨酸的荧光检测，检出限分别为０．０２，０．０５，０．１６，０．１５，０．１２μｍｏｌ·Ｌ－１，对Ｄ－青霉胺的检出限为１．１μｍｏｌ·Ｌ－１。Ｌａｐｏｓ等报道了一种在微流控芯片上同时进行安培／荧光双检测的方法。对多巴胺、儿茶酚、ＮＢＤ－精氨酸与ＮＢＤ－苯丙氨酸荧光检测的检出限分别为０．４４８，１．５２，１６，１８μｍｏｌ·Ｌ－１。
５展望
荧光检测技术为微流控芯片分析研究提供了更为灵敏的检测手段。多通道阵列芯片上荧光检测系统，将满足药物筛选和基因测序等领域高通量的需求。超高亮度ＬＥＤ的面世以及使用脉冲电源供电方式增加ＬＥＤ激发光强、联合液芯波导技术的应用，以及与其他检测技术联用等措施，能够进一步提高灵敏度，降低检出限，扩大应用范围。
微流控分析技术自２０世纪末兴起后，取得了迅速的发展。但目前商品化的荧光检测器，在不同程度上存在着价格昂贵、维护费用高、兼容性差等局限性。因此，研制成本低廉、集成度高、适合于商品化的微流控芯片荧光分析仪，成为当前分析仪器发展的重要目标之一。
（文章来源:张雯，钱金雄，肖彦革，陈缵光*《微流控芯片荧光检测系统研究进展》转载仅供参考学习及传递有用信息，版权归原作者所有，如侵犯权益，请联系删除）
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