崔华：基于智能手机和微流控芯片建立的时间-空间-彩色多分辨化学发光成像免疫分析检测系统

引语

化学发光(CL)是在没有光源和光谱系统的情况下，化学反应产生的光发射，其在信噪比、灵敏度和线性范围方面有很大的优势。化学发光(CL)生物检测已成为临床诊断的主要技术之一。一般来说，单一的标志物的检测对于疾病的准确诊断是不够的。因此，多种生物标志物的测定越来越受到人们的关注。如何在单个芯片上实现对多个标记物的同时检测和快速准确诊断仍是一个巨大的挑战。

 本研究首次报道了独特的时空彩色多分辨化学发光成像系统并用于多重免疫测定。该创新策略具有灵敏度高、选择性强、操作简单、成本低等优点，避免了复杂的标记过程和来自相邻检测区的干扰，这项工作为多路分析的时间-空间-彩色多分辨成像打开了一扇门。

如示意图所示，在双层纸基微流控衬垫的顶层有注射区，在毛细管力的驱动下，可通过亲水微通道自动、有序地输送反应试剂到三个检测区域。自动触发CL和共振能量转移(CRET)反应，并由智能手机摄像头记录时间-空间-彩色多分辨CL成像信号。

成果简介

1. 时间-空间-彩色多分辨CL成像系统介绍。

如附件视频S1所示，1号检测区域信号为黄绿色发光，在20秒左右开启，在32秒关闭。2号检测区域为蓝色发光，在35秒左右开启，在48秒左右关闭。3号检测区为蓝绿色发光，在55秒左右开启，在90秒左右关闭。由此得到了时空彩色多分辨闪烁型CL成像信号。由于相邻探测区的光发射间隔时间较长(大于2 s)，采用时空分辨CL成像策略，相邻光发射之间完全不存在干扰。鲁米诺-双氧水-ZIF-67体系的发光光谱在440 nm处表现出最大的发光波长(图S2)，与荧光素和吖啶黄的激发波长匹配良好，为实现CRET反应提供了一个平台。鲁米诺-双氧水-ZIF-67-荧光CRET体系的发光光谱在530 nm处表现出最大的发射波长(图S2)，证明从LO₂^2-*到荧光素(F^2?*)的有效能量转移，对应于1号检测区发射黄绿色光。鲁米诺-双氧水-ZIF-67-吖啶黄CRET体系的发光光谱在500 nm处表现出最大发射波长(图S2)。验证了从LO₂^2-*到吖啶黄的有效能量转移，形成3号检测区蓝绿色发光。

2.沸石咪唑酯骨架结构材料ZIF-67用于检测系统。

在没有沸石咪唑酯骨架结构材料ZIF-67的情况下，使用智能手机时，光的发射相当微弱，无法检测到。利用ZIF-67作为催化剂，提高了鲁米诺体系的电化学发光性能。在这个研究发现，ZIF-67还可以增强鲁米诺-双氧水反应的CL。TEM图像和XRD结果(图S3A,B)表明，ZIF-67颗粒为十二面体晶体结构，边长约200 nm。 ZIF-67的EDS结果(图S3C)表明，ZIF-67的主要元素为C、N、Co，电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)测定的ZIF-67的Co含量为9.73%。ZIF-67纳米结构中原子分散的阳离子可以促进双氧水的分解，生成高活性的羟基自由基(OH*)。OH*与鲁米诺反应生成鲁米诺自由基。然后与O₂反应生成O₂*^-。最后，O₂*^-与鲁米诺自由基反应产生强CL发射。鲁米诺-双氧水-ZIF-67体系CL反应的强度分别比鲁米诺-双氧水和鲁米诺-双氧水-Co(Ⅱ) 增强了50倍和3倍(图S3D)。ZIF-67催化多色光发射的机理如图S4所示。

3.时空彩色多分辨CL成像系统视频检测模式验证。

不同浓度CEA、AFP、PSA存在时三个检测区域的叠加图如图2A-C所示。可见，在CEA、AFP、PSA检测区叠加的图片中，分别记录了1个黄绿色、1个蓝色、1个蓝绿色圆形光点。三个光斑的CL强度分别随着CEA、AFP、PSA浓度的增加而逐渐降低。此外，如果用Co(Ⅱ)离子取代ZIF-67，光发射与相应抗原的浓度关系不大。因此，ZIF-67是制造该免疫分析系统的关键。

以ZIF-67为主的CL免疫分析的可能机制如图S5所示。在传感界面上特异性免疫反应形成的大免疫复合物阻碍了ZIF-67颗粒向纸基的运输，并在纸基ZIF-67催化剂和CL试剂之间形成蛋白型障碍，同时该免疫复合物可以阻断自由基在CL和CRET反应中的电子转移，抑制了ZIF-67的催化作用，导致抗原依赖模式下的光发射明显减少。通过计算每个光斑的灰度值，实现了CEA、AFP、PSA的定量。如图2D-F所示，得到了三条线性校准曲线。CEA的检测回归方程为ΔGray = 2.07 l0g C + 29.92, R² = 0.9973,检测范围为1 pg/mL ~ 10 ug/mL。AFP的ΔGray = 4.19 logC+ 51.56, R²0.9970，检测范围从10 pg/mL到0.2 ug/mL。PSA的ΔGray = 8.32 log C + 122.30, R²= 0.9985，检测范围为10 fg/mL到50 ng/mL。ΔGray通过空白灰度值与相应抗原灰度值相减获得，C为浓度(g/mL)。CEA、AFP 和 PSA的检出限为0.2 pg/mL，3.2 pg/mL和 4.2 fg/mL.

4. 时空彩色多分辨CL成像系统照相检测模式验证。

在2分钟的曝光时间下在一张照片中记录三个圆形且均匀的光斑，这些光斑与反应相对应(图3)。不同浓度CEA、AFP、PSA的图像如图3A所示。空白缓冲液存在时，三个光点非常强，但随着CEA(绿黄色光斑)、AFP(蓝色光斑)和PSA(海蓝宝石色光斑)浓度的增加，三个光点的强度逐渐减弱。如图3B所示，得到了三条线性校准曲线。CEA的ΔGray = 6.78 log C+81.54, R² = 0.9962,检测范围为5 pg/mL ~ 1 ug/mL。AFP的ΔGray = 9.63 log C+ 121.62, R²= 0.9899, 检测范围为1 pg/mL ~ 100 ug/mL。PSA的ΔGray = 22.73 logC + 262.21, R²= 0.9969, 检测范围为5 pg/mL ~ 0.2 ug/mL。测定CEA、AFP、PSA的检出限分别为2.1 pg/mL、0.4 pg/mL、3.9 pg/mL。在CEA、AFP和PSA检测中，检测范围和检测限优于先前报道的CL μpad(表S1)。这种良好的敏感性主要归功于ZIF-67对CL和CRET反应的巨大催化作用，以及本文提出的抗信号干扰策略。虽然照片检测模式和视频检测模式有相似的成像性能和线性检测范围，但是照片检测模式的发光强度的变化梯度与抗原浓度的变化(表示灵敏度)高于视频检测模式。而且照片检测模式更简单、方便，对数据存储和数据处理的要求更少。因此，对于时空彩色多分辨CL成像检测来说，照片检测模式是最佳的检测模式。在智能手机上进一步开发了自编译应用程序(APP)以便用于智能检测。

5. 照相检测模式免疫试剂的选择性研究。

采用免疫球蛋白G (IgG)、人白蛋白、人纤维蛋白、肽素、心脏型脂肪酸结合蛋白(H-FABP)、心肌钙蛋白I (cTnI)等多种蛋白作为可能的干扰物。如图3C所示，从检测区域相应抗原得到的ΔGray值与含有相应抗原的混合物得到的ΔGray值具有可比性，而从非特异性抗原得到的ΔGray值信号非常微弱。结果表明，所建立的免疫分析方法具有较好的选择性。相对标准差(RSD)为3.26% ~ 6.57%(表S2)。结果表明，该系统具有较高的检测精度。通过测定人血清中的CEA、AFP和PSA，进一步研究了所提出的免疫测定方法的实用性。得到满意的回收率(92-108%)(表S3)。并对所制备的衬垫的贮存稳定性进行了研究。在4℃密封超过30天后，没有观察到明显的信号变化，这表明储存稳定性是可以接受的。因此，所开发的CL免疫测定法适用于临床诊断。

图文导读

图1 检测视频不同时间典型截图的叠加图像，图像分别对应检测区域1(A)、2(B)、3(C)产生的光发射

图2 检测区1(A)、2(B)和3(C)号在不同浓度的CEA、AFP和PSA存在时的堆叠图片。CEA (D)、AFP (E)、PSA(F)为视频检测模式的代表性校准曲线

图3 (A)检测不同浓度CEA、AFP和PSA时的照片。(B)采用照片检测模式进行CEA、AFP和PSA检测的典型校准曲线。(C) CL免疫测定的干扰研究，分别设置十个干扰组。

小结

首次利用双层纸基微流控与智能手机结合，开发了用于多重免疫测定的时间-空间-彩色多分辨化学发光成像免疫分析检测系统。双层纸基微流控包括运输核心反应物的底层和发生免疫反应、CL反应和CRET反应的检测区域的顶层。在不同检测区的鲁米诺、鲁米诺-荧光素、鲁米诺-吖啶黄结合特异性抗体进行固定。加入抗原和ZIF-67后，双氧水被依次运送到不同的检测区域。然后，利用智能手机作为便携、方便的检测设备，触发ZIF-67催化鲁米诺-双氧水CL和CRET反应，产生时空彩色多分辨CL成像信号。同时，开发了一款在智能手机上运行并用于智能检测的应用程序。CL成像检测可采用视频检测模式或照片检测模式进行。作为概念验证，开发免标记的CL免疫测定法用于测定三种癌症模型生物标志物，包括CEA、AFP和PSA。时空彩色零分辨CL成像策略具有灵敏度高、选择性好、简单、低成本等特点，可以避免复杂的标记程序和邻近检测区的干扰，可用于开发各种免疫分析方法，在临床诊断、食品安全评价、环境监测等领域具有巨大的应用潜力。

原文链接：

https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acs.analchem.0c01405

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