基于微流控技术的外泌体分析方法

随着技术的进步,外泌体检测的各种方法不断涌现,前面介绍的方法往往需要相对庞大和复杂的实验室基础设施。近年来,微流控技术高速发展,许多基于微流控技术的外泌体检测方法不断被报道,这些检测方法具有分析速度快、灵敏度高、试剂消耗少、携带方便等优点。此外,微流控技术易于模块化并可多单元集成,这意味着可以将外泌体的纯化、富集和检测整合到微流控平台上,为临床发现外泌体生物标志物和对肿瘤等疾病的诊断与预后提供巨大的潜力。目前基于微流控的外泌体分析方法大致可以分为:荧光检测、表面等离子体共振、核磁共振、数字液滴PCR、电化学传感等,下面将对提到的这几种方法进行详细的介绍。

4.1 荧光检测

荧光是一种物质在吸收光照或者其他电磁辐射后出现冷发光的现象。其荧光强度、波长、发光时间与材料的性质有关。因此,观测荧光的发射参数可以用来检测目标样品。荧光成像技术具有精度高、灵敏度高等优点,已广泛应用于微流控芯片的外泌体检测系统中。近期的研究报道中,Ai等建立了一种微流控水动力分析平台,该平台首先利用微珠对溶液中的外泌体进行初步的捕获,然后利用微流控芯片将富集有外泌体的微珠进行分散与固定,在芯片上实现了外泌体的大规模多重荧光分析(见图6a)。

而Hansford等则构建了一种经过抗体功能化的人字形沟槽微流控装置,在实验中,研究人员将其用于高级别浆液性卵巢癌病人血清中外泌体的分析,利用荧光显微镜对微流控芯片捕获和释放的外泌体进行表征,从而实现了外泌体的洗脱过程的动态监测(见图6b)。流式细胞术(FCM)和微流控技术相结合在外泌体检测方面也有很大的潜力。一种基于微流控技术的多功能流式细胞仪成像检测系统已被用于卵巢癌的早期检测,该方法通过建立由平行纳米通道组成的流式细胞术阵列,成功地实现了外泌体的计数。从发展趋势来看,基于微流控芯片的荧光检测方法在外泌体检测中的应用将会越来越广泛。

4.2 表面等离子体共振

表面等离子体共振(SPR)是一种无标签的实时跟踪传感技术,通过分子吸附在金属表面引起的折射率改变实现对生物分子的痕量分析。近年来,基于SPR技术的纳米传感器因其在分子检测上的高灵敏性而备受关注。Hu等开发了一种基于SPR的外泌体微流控芯片传感器,实验中该团队将抗体修饰在金的表面,在利用抗体微阵列捕获外泌体后,金表面的折射率发生改变,实现了对肿瘤细胞培养液中的外泌体的定量检测,为外泌体的分离分析提供了一种简便、高效的策略。

4.3 核磁共振

核磁共振现象(nuclear magnetic resonance, NMR)是一种基于磁矩不为零的原子核在外磁场作用下自旋能级发生塞曼分裂,共振吸收某一定频率的射频辐射的物理过程,由Purcell和Bloch在1946年发现。NMR是化学分析中的一项重要技术,Lee等将用于NMR测量的微线圈嵌入到微流控芯片的中间层,用抗体和外泌体作用后与磁性纳米颗粒进行偶联,使用内置微线圈进行核磁共振测量,以确定样品的R2值,实现了对外泌体膜蛋白的检测。

图6   微流控芯片与荧光检测联用用于外泌体检测

4.4 数字聚合酶链式反应

数字聚合酶链反应(dPCR)是一种绝对定量的方法,它将含有核酸模板的标准PCR反应体系,平均分配成上万个和数百万个PCR反应,使每个反应中尽可能含有一个模板分子,在单分子水平上进行大规模的平行PCR分析。dPCR检测目标基因更可靠,不需要校准曲线。由于其高灵敏度,dPCR已广泛应用于多个领域,包括单细胞分析、突变检测、拷贝数变异分析、细菌和病毒检测等。可以设想,随着微尺度样品处理与dPCR分析的集成,该技术将成为临床样本中外泌体基因分析的有力工具。

4.5 电化学传感

电化学分析方法因其具有成本低、时效性好、灵敏度高、样品量少等优点在生化检测领域受到广泛关注。在电化学检测过程中,将识别元件(如抗体、适配体等)修饰到化学电极上与外泌体特异性结合,再利用不同的电化学检测技术(包括伏安法、安培法、阻抗法、电位法等)对电极进行检测便可以获取样品中外泌体的浓度和表面蛋白等信息。Revzin等报道了一种基于适配体的电化学生物传感器用于外泌体的定量检测:将外泌体跨膜蛋白CD63适配体固定在金电极表面上与含有亚甲基蓝标记的探针链杂交,当检测到外泌体时,探针链会释放出来,电化学信号以与分析物浓度成正比的方式降低;将该装置整合到微流控芯片中,可以对外泌体浓度在1×106~1×108个粒子/mL的样本进行定量检测。Ye等则以聚二甲基硅氧烷为主要材料,构建了内部含有人字形微阵列结构的电化学检测芯片(见图7),当检测到外泌体跨膜蛋白CD63时,吸附有外泌体的磁珠可与一种DNA发卡结构结合,在血清素的作用下,发卡结构异构成G-四聚体结构,对过氧化氢分解具有高效的催化作用,而产生强烈的电化学信号,从而实现对外泌体的检测;在对临床血清样品中CD63阳性外泌体定量检测中,文中开发的两步级联微流控平台,可以实现对健康组和疾病组的外泌体含量的灵敏区分。

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