纸芯片微流控技术的发展及应用
纸芯片微流控(Paperbasedmicrofluidics)或微流控纸基分析设备(Microfluidicpaper-basedanalyticaldevices，μPADs)简称纸芯片，是微流控芯片中的最新发展领域，由Whitesides研究组［4］在2007年首次提出。纸芯片是以纸代替传统的石英、玻璃、硅、高聚物等材料，在纸的表面加工出具有一定结构的微流体通道的微型分析器件，结合了微流控技术和纸的优点。与传统的微流控芯片相比，纸芯片具有以下优势［5－9］:①纸来源丰富，可进行批量生产;②不需要外接泵，纸的主要成分是纤维素，流体在纸上通过毛细作用流动;③试样消耗量更低;④检测背景低，有利于光度法检测;⑤生物兼容性好，可通过化学修饰改变纸的性质;⑥一次性便携式分析，操作简便，甚至不需要专业的操作人员。纸芯片为临床诊断、环境监控以及食品安全分析中需要的便携式检测和现场实时监测提供了一个广阔的平台。此外，对于医护人员和医疗设备紧缺的欠发达地区，纸芯片是低成本、检测迅速的即时诊断(Point－of－caretesting，POCT)的有力工具。
纸芯片的发展可追溯到17世纪，英国化学家罗伯特·波义耳偶然发现石蕊地衣中提取的紫色浸液遇酸变红色，遇碱变蓝色，并利用这一特点制成了酸碱试纸———石蕊试纸。1949年，Müller及其同事用石蜡浸渍滤纸形成一定的通道，发明了用于洗脱色素的纸上薄层色谱［10］。从此以纸为载体的分析诊断设备开始出现。其中，以验孕棒为代表的免疫色层分析试纸，即侧向层析检测(Lateralflowassays，LFAs)［11］是纸芯片技术发展中的一块里程碑。市面上陆续出现用于检测糖尿病、病原体生物标志及其他传染病的纸基即时诊断设备［12－13］。这类检测主要包括样品垫、结合垫、检测垫以及吸收垫。具体原理是向样品垫加样后，样品溶液在毛细作用下流经结合垫，预先加入并干燥的带有信号指示剂的抗体和目标抗原结合，形成抗原/信号－抗体结合物，共同流向检测垫，随后和固定在检测垫表面的捕获抗体结合，从而获得信号输出。吸收垫用于吸收样品溶液，从而可以增加进样量进而提高检测的选择性。其中，彩色乳胶微球或金纳米颗粒常被作为信号分子［14］。此类试纸检测因操作简单、成本低且携带方便而取得了巨大成功。然而，侧向层析检测对样品量需求大，且不适用于多重分析和定量分析［15］。而纸芯片的出现突破了传统试纸检测的局限，使低成本、低耗样量的便携化定量检测成为了可能。图1罗列了纸芯片发展过程中的里程碑事件。图2为不同时期的纸基芯片示意图。
图1纸芯片微流控技术发展的里程碑事件
一、纸芯片的制作
纸芯片制作的基本原理是在纸面上形成通道从而实现对流体的引导。根据形成通道的方法不同可以分为以下几类:直接切割制成通道;在滤纸上修饰诸如石蜡、光刻胶、烷基烯酮二聚体等疏水性材料形成通道;使用聚二甲硅氧烷、聚苯乙烯或聚亚胺酯等聚合物来封闭多孔结构从而形成物理屏障。其中，在滤纸上用疏水性材料形成通道是目前最常用的方法，但该方法不适于含有胆固醇等亲油性物质的试样。
除了滤纸外，根据不同需要，其他类型的纸也可以被用作纸芯片的基底。例如，硝化纤维膜对生物分子有较高的非特异吸附，适合固定DNA［24］、酶［16］以及蛋白质［25］等生物分子;蜡光纸韧性好、降解性低、表面光滑，可在其表面固定纳米粒子［26］;纸巾的吸水性强，固定凝聚血细胞效果好［27］。
1.常用的制作方法
手工加工
①蜡画 Lin等尝试直接用蜡笔绘制图案以及用蜡笔临摹打印出的图案这两种方法该方法简单省时，不需要昂贵的仪器并且无需专业人员操作，但仅适用于图形简单的纸芯片制作。
②聚合物油墨绘画或压印Whitesides等先将光胶涂在滤纸上，然后贴上透明胶带，用笔直接在胶带上绘制图案，经紫外光照射后再撕下透明胶带，得到印有图案的纸芯片(图3B)。该方法不需要使用模具，简化了传统的光刻制作法。
③石蜡压印DeTarsoGarcia等使用金属印戳在涂满石蜡的滤纸上一步制成树枝状的纸芯片图案，进一步用比色法进行检测(图3C)。该方法快速省时，成本低且可以大批量生产。
模具加工
①石蜡浸渍Laiwattanapaisal等将铁制模具放置于平铺在载玻片的滤纸上，并在载玻片的背面放上一块磁铁，然后浸入液态蜡中，待冷却后再取出滤纸，从而得到相应图形(图3D)。该方法成本低，但需要模具，并且难以控制浸渍蜡的时间，重现性较差。
②光刻法Whitesides课题组［4］最早利用光刻法制作纸芯片。将SU－8光胶涂在滤纸表面并甩匀后，利用紫外灯照射，根据透明模具的形状对光胶进行聚合，形成通道，再洗去未交联的光胶，从而得到高分辨图案(图3E)。该成果是纸芯片研究领域的一大突破，为简便、廉价以及可携带的检测应用提供了一种可能。但光刻制作步骤繁琐，成本高并易受背景影响。
③石蜡丝网打印Henry等［32］在丝网印刷模具上印上石蜡固体，然后加热融化，形成疏水阻挡层，从而制得纸芯片(图3F)。该方法成本低，操作方便，可批量生产，但石蜡在纸上不均匀的沉积会导致分辨率较低。
打印
①石蜡打印石蜡打印法是目前最常用的方法，由Lin等首次报道，Whitesides等进一步建立了石蜡在滤纸表面加热融化的速率计算模型。具体操作为先用石蜡打印机打印预先设计的图案，然后加热使石蜡融化渗透至滤纸中，形成疏水阻挡层(图3G)。其中，XeroxPhaser8560N石蜡打印机使用最广泛，其石蜡墨在120℃开始融化，便于后续的加热操作。该方法快速(5min内完成)、简单、成本低(打印一张8.5英寸×11英寸WhatmanNo.1滤纸的成本为0.60美元)，特别适于大批量生产对分辨率要求不高的纸芯片。
②喷墨侵蚀Citterio等先用聚苯乙烯浸润滤纸，然后将甲苯反复打印在特定区域以除去表面的聚苯乙烯，从而形成亲水通道，再在相应区域打印化学或生物试剂，用于后续检测(图3H)。该方法能够在绘制图案的同时固定反应试剂，但不适合批量生产。
③喷墨打印Li等［23］先用喷墨打印机在设计的图案上打印AKD材料以将滤纸部分疏水化，然后再加热，确保打印区域完全疏水化，从而形成通道(图3I)。此方法不需要模具，可批量生产。
④柔印Erho等［34］通过柔印打印将聚苯乙烯渗入滤纸，形成疏水坝，而未被打印的区域依然保持亲水性，从而形成通道(图3J)。该方法虽然快速，可批量生产，但加工过程复杂，需要不断重复以确保通道完全疏水化。
切割
①工艺刀切割工艺刀切割［35］是利用电脑控制刀，根据不同的切割力度和角度制作相应的图案，但通常要在底部加上保护层以避免滤纸被割破(图3K)。与手工切割方法相比，该方法不仅提高了分辨率，还在制作时间和生产数量方面有了进一步优化。
②激光切割激光切割［36－38］(图3L)不需要在底部加上保护层，但制备成本大，需要专门的激光切割仪器。Crooks等［39］利用激光切割法将设计的通道切除，形成中间镂空的夹心型纸芯片传感器，大大提高了流体在纸芯片的流动速度。
图3纸芯片的制作方法原理图
2.3D纸芯片
传统的2D纸芯片无法实现高通量、多靶标、多步反应的检测，并且容易产生试剂的交叉污染。而3D纸芯片的出现突破了2D纸芯片的局限，能够集成复杂的网络通道，并实现样品的快速分配等。3D纸芯片具有多层结构，其常用的制作方法有两种，利用双面胶将平面图案多层叠加固定或手工折叠。
Whitesides等用双面胶固定多层印有不同图案的纸，设计了一个用于同时检测葡萄糖和蛋白质的3D纸芯片。该纸芯片的最上层有4个加样口，底部含有16个检测区。加入待测样品后，样品在毛细作用下达到最底层，与检测区预先加入的试剂反应，产生肉眼可直接观察的颜色变化。该设计将复杂的反应通道隐藏在装置中，只呈现最终的检测区域，便于结果的读取和分析(图4A，B)。而Crooks等［21］利用折纸的方法，同时用比色法和荧光法检测葡萄糖和蛋白质。该设计的优势在于3D结构的纸芯片可以随时还原至平面结构，并任意一层进行定量或半定量分析(图4C)。此外，Lewis等［43］发明了一种快速批量制作3D纸芯片的方法，先用石蜡打印机批量制作平面图案，然后用喷雾胶粘贴一层空白滤纸，打印新的图案，再重复以上步骤。此方法可一次性制造200～300个3D纸芯片，简单高效。
图4 3D纸芯片示意图
二、基于纸芯片的检测方法
纸芯片常用的检测方法主要有光度检测法、荧光法、化学发光、电化学发光法，以及电化学检测法。其中，光度检测法和电化学方法目前应用最为广泛。
光度检测法
光度检测法是最直观、最常用的一种方法。该方法通过显色反应，如酶联反应、基于纳米粒子或量子点的颜色变化，将待测物质转化为有颜色的物质，根据颜色变化的程度和待测样品浓度的关系，进行半定量或者定量分析。可利用肉眼观察进行半定量分析，但通常会因为不同检测者的视觉感官不同而产生误差。因此需进一步借助扫描仪、相机将检测结果转为图片，然后用ImageJ、PS等图像处理软件将颜色转化为灰度值，再根据灰度值和待测物浓度的关系进行定量分析。该方法的局限在于易受光线的影响，灵敏度和选择性不及电化学方法。目前，光度检测法主要用于：生物分子、离子、血液标本等。
荧光法
荧光法的选择性好、检出限低，但需要借助外接仪器，并受纸中荧光素产生的背景干扰。据文献报道，利用荧光法可在纸芯片上检测蛋白质、细菌］以及DNA。
化学发光法
化学发光法是根据化学反应在某个时刻发射的光强度来确定反应中某一组分浓度的方法。该方法灵敏度高、设备简单、成本低、线性范围宽、重现性好，可在黑暗环境中操作并可结合微加工技术进行分析。
电化学发光法
电化学发光法是将化学发光法与电化学技术相结合的一种新型技术，利用电化学反应进行发光，光学背景信号低、反应可控性强，通过控制电极电位可调节检测的选择性，具有良好的应用前景。
电化学方法
电化学方法的灵敏度高、选择性好，检测区不受光线的影响，耗样量少，成本低，易于集成，并且技术成熟，已被广泛应用于葡萄糖、胆固醇、维生素C、DNA及核酸、离子及气体等物质的检测。
纸芯片微流控技术因其廉价、高效、耗样量少、便携、制作简单、操作方便等优势引起广泛关注，其设计符合世界卫生组织(WHO)针对在欠发达地区使用的诊断设备提出的“ASSUＲED”原则［98］，并已被广泛应用。近年来，纸芯片手机［16］等移动设备的结合促进了远程医疗以及家庭护理的发展。该体系的优点在于提高了即时诊断的便携性和普遍性，使现场采集的数据能够通过移动设备传送到分析中心，从而避免了试样运输带来的麻烦。迄今为止，纸芯片与移动设备联用体系已经成功用于噬菌体和细菌病原体［99－100］、药物［101］、生物标记物［51，102］、有毒金属［103］以及爆炸物［104］等物质的检测。但该体系易受外界光线影响，导致图案色彩强度前后不一致。为了解决此问题，许多课题组开始设计手机图像校正软件［105］或挡光器件［106］。
作为一门新型技术，纸芯片微流控领域还有许多课题有待研究，如:开发更多类型的纸芯片扩大其应用范围;寻找更简单、廉价的制作方法;将纸芯片和新型材料结合增强生物兼容性以实现纸芯片的商品化;研究流体在纸芯片上的驱动机理，实现更精准的控制;与更多的检测方法结合;延长试剂在纸芯片上的储存时间及纸芯片的寿命;与检测仪器集成实现便携化检测;提高纸芯片检测的重现性和检出限;优化检测结果的输出形式使纸芯片方便非专业人士的使用;减小外界环境对检测的影响等。
通过不断的优化，纸芯片微流控将不局限于欠发达地区的医疗诊断，还可以为发达地区的现场急救、临床试验、医疗保健提供低成本的诊断途径，并在临床诊断、食品安全分析以及环境监控等领域有着良好的发展前景。
文献：纸芯片微流控技术的发展及应用（田 恬，黄艺顺，林冰倩，魏晓峰，周雷激，朱 志，杨朝勇*） doi: 10. 3969 / j. issn. 1004 － 4957. 2015. 03. 002
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