微流控芯片在水环境污染分析中的应用

水环境是环境构成要素之一,也是受人类破坏和影响最严重的领域,水环境污染已成为当今世界主要环境问题之一,水环境科学研究特别是水环境污染分析备受瞩目.水环境污染分析对象种类广、含量低,因此分析手段必须具备灵敏、准确、高速、自动化等特点.为了解决所面临的种种现实问题,水环境污染分析动用了现代分析化学中几乎所有的检测技术和手段,如使用等离子发射光谱、原子荧光光谱、气相色谱鄄质谱联用、高效液相色谱等.在继续发展大型、精密监测系统的同时,小型便携式、自动连续、简易快速的监测技术的研究同样迫在眉睫.例如,在污染物突发事故或野外连续观测的现场,由于水体流动的因素,污染物浓度的变化十分迅速,大型固定仪器的使用受到限制,而便携式仪器和快速、自动连续测定技术就显得十分重要.在这一领域的研究过程中,微流控芯片技术起到了极其重要的作用.

一.微流控技术在水体污染物分析中的应用

进入水环境的所有污染物质均属于环境分析的研究对象.按照其毒性、危害和受关注程度分为环境优先污染物和其他环境污染物.微流控芯片技术在水环境污染分析中的研究应用尚处于起步阶段,因此多集中于优先污染物的相关报道,主要包括重金属、营养元素、有机污染物和微生物等.

1.用于水体中重金属检测的微流控芯片系统

图1重金属检测微流控芯片系统

随着工农业的发展,越来越多的重金属如汞、镉、铬、铅、铜、锌、镍、钡、钒等被排放入水体,不仅会对水生动植物产生毒害作用,还能通过富集作用进入生物链,对整个生态环境构成严重威胁.对上述重金属的检测,虽然可以使用高精度的原子吸收光谱和原子荧光光谱等方法,但是在应对突发性污染物泄露事件,或者对一个区域进行连续监测的情况下,仍需要快速、高效的检测工具.Green-wood和Greenway使用光刻法搭配湿法刻蚀技术,成功研制了一种微流控芯片.该芯片利用鲁米诺发光的性质,成功地对硝酸钴进行了测定,检测最低限度为3X10-11mol·L-1.该装置使用造价低廉的光电探测器,在保证了高敏感度的前提下降低了成本,而且将试剂固定在了微芯片之上,实现了操作的自动化.与此同时,通过简单的改造之后,该微全分析系统还能成为检测过氧化氢或者二氧化氮的装置,并可以与信号传递装置结合起来,成为一种自带无线信号发射功能的设备.Alves-Segundo等[32]使用发光二极管和光电二极管,搭配低温共烧陶瓷,制造了一种基于光度检测的连续流动分析微芯片(图1A).该装置使用二苯基甲酰胺作为显色剂对六价铬进行测定,在0.1~20mg·L-1的范围内表现出良好的线性关系,同时其检测限最低为50μg·L-1.

基于纸的微流控器件近几年的发展也很迅速[33],相对于具有类似功能的微流控设备[34],它具有操作简单,不需要外援设备,可多元检测等优点,有望成为最廉价的分析检测器件.Hossain和Bren-nan[35]利用β-半乳糖苷酶(β-galactosidase)在重金属离子的抑制下会失去活性的性质,配合其他的金属指示剂,开发出了一种可以用来检测多种重金属的纸芯片(图1B),显示了良好的灵敏度.

2.营养盐测定芯片

用于营养盐测定的微流控芯片系统多数是基于分光光度法的检测原理,运用现代微细加工技术将各种光电元件加以集成.例如,都柏林城市大学的McGraw等[36]利用钼酸铵与磷酸盐反应产生特征黄色或黄绿色这一特点,研制了一种用于水体中磷酸盐监测的微流控芯片系统.该系统配有数据的发射装置,可以在目标区域的不同位置分别布置,对该区域的磷酸盐污染状况进行全方位的实时监测,检测限最低为0.3mg·L-1.贾宏新等[37]提出了一种三层杂交结构微流控芯片[玻璃片/聚二甲基硅氧烷(PDMS)膜/PDMS底片],在玻璃片上加工微反应通道,用PDMS加工气体渗透膜和具有接受通道的PDMS底片,实现了溶液中NH4+反应、生成的氨气扩散分离、吸收、溴百里酚蓝显色和光度检测在微流控芯片上的集成化.理论上任何基于流动注射分析技术-分光光度法的营养盐测定均可在微流控芯片中实现.但由于微米尺度的微流控芯片通道的吸收光程和光通量均受到很大限制,因此这一类技术的突破点在于芯片上长光程检测的实现。

此外,利用毛细管电泳的微流控芯片技术在营养盐的检测中也得到了良好的运用.Shiddiky等[39]制造了一种基于毛细管电泳技术的微流控芯片,该系统可以在90s内,同时对亚硝酸盐离子和硝酸盐离子完成检测,最低检测限分别为(0.09±0.007)μmol·L-1(NO2-)和(0.08±0.009)μmol·L-1(NO3-).Sieben等[40]也做了相似的研究,制造了一种用来检测亚硝酸盐的微流控装置,其检测限为14nmol·L-1.

3.有机污染物分析芯片

水体中除含有无机污染物外,更大量的是有机污染物,它们以毒性和使水中溶解氧减少的方式对生态系统产生影响,危害人体健康.因此有机污染物的数量是评价水体污染状况的极为重要的指标.这一类污染物由于其含量较低,通常需要进行前期的预处理,微流控芯片的优点体现在可以将前期的预处理以及后期的检测进行集成,并且具有较高的萃取/富集效率.Benhabib等[41]利用基于光谱分析技术的微流控芯片,对多环芳烃(polycyclicaromatichydrocarbons,PAHs)进行了检测,其检测范围为0.1μg·L-1~400mg·L-1.Nie等[42]制造了一种用介孔材料(CMK-3)修饰的碳盘电极的电化学检测芯片,可以检测水中的硝基苯类化合物(nitroaroma-ticcompounds,NACs).该装置使用毛细管电泳装置来分离4种硝基苯类化合物,在样本没有经过复杂预处理的情况下,其在饮用水中的最低检测限能达到3.0~4.7μmol·L-1.Shen等[43]制造了一种微流控芯片,使用毛细管凝胶电泳技术,搭配激光诱导荧光检测法来检测水体中的溶解有机碳(dissolvedor-ganiccarbon,DOC).通过对日野川(HinoRiver)和琵琶湖(BiwaLake)的水样分析得知,在经过孔径为0.45μm的滤膜之后,可以检测出浓度为1~2mg·L-1的DOC.Ha等[44]利用基于毛细管电泳鄄安培检测系统的微流控芯片,对双酚A为代表的一些内分泌干扰物进行了检测.该系统的主要结构是采用普鲁士蓝修饰的氧化铟锡(ITO)电极,并配合弯曲的微通道.经过微通道的有效分离之后,该系统对于双酚A的检测限为59nmol·L-1.然而该芯片目前只应用于检测被泡沫塑料污染过的水体,这仅仅是对于内分泌干扰素检测的初级阶段,对于科研工作者而言,下一步要做的工作是对更广泛的污染物检测进行深入的研究.

4.微生物检测芯片

水体中的微生物按其粒径,属于颗粒有机碳(particularorganiccarbon,POC)范围,其种群丰度可以反映水体生态特征和一些重要的污染状况(如大肠杆菌可反映水体受粪便污染的程度、赤潮藻丰度可预警或指示赤潮,而嗜油菌丰度可显示水体受溢油危害程度等),是水体生态调查中的常规监测指标.在其测定过程中,流式细胞术是最为准确、快速的方法.但其设备昂贵、体积庞大、需要专人操作,不适应现场、连续监测要求.基于鞘流式流体控制的微流控芯片的出现在一定程度上克服了这些局限,并可能实现仪器的集成化、小型化、自动化和便携化.其测定原理与流式细胞仪相似.首先对细胞进行荧光标记(可发出自体荧光的无需标记),采用电动力、压力或空气夹流等形成鞘流的方式实现细胞进样,细胞流经激光诱导荧光检测区后,根据检测到的荧光信号的有无和强弱进行计数,并可借助多种控制方式(如电[45]、光镊[46]和泵阀[47]等)进一步完成细胞分选。

除了上述基于流式细胞术原理的微流控芯片以外,免疫分析和分子杂交也是较为常用的技术.Bey-or等[48]开发出了一种固定了免疫磁珠的微流控芯片,可以从稀释的样本中检测并分离出大肠杆菌O157：H7.通过芯片外的PCR预处理技术和芯片中的毛细电泳技术,可以有效提高捕获细胞的效率.该芯片对于微生物的捕捉效率为70%,其检测限为2cfu·μL-1.与此相似,Dharmasiri等[49]制造出了一种以聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)为材质,并且经过多克隆抗体pAb修饰的微流控多通道芯片,可以同时检测8个不同的样本,也可以对同一个样本进行8个平行检测,检测下限为6~10cfu·mL-1.该芯片的优点可以对样品进行预浓缩和富集,避免了潜在污染物对目标分析的干扰.Metfies等[50]利用分子杂交技术,开发出一种使用rRNA作为探针的微流控芯片.该芯片拥有两段18SrRNA作为探针,可以形成两个特异性检测区域,在将微生物破碎,提取总DNA并进行PCR以后,成功地对亚历山大藻(Alex-andriumostenfeldii)进行了检测.

二、基于微流控芯片的水污染生物监测系统

水环境污染分析除了要阐明水体污染物质的组成、状态和含量以外,还要分析水体污染状况并对水环境的生态风险做出评价.在此过程中,为了补充物理、化学分析方法的不足,主要采用生物监测法.在水污染的生物监测法中指示生物可采用水生微生物、植物和动物等.由于芯片尺寸微小,通道是微米级别的,与细菌、微藻类相匹配.因此,该类生物被较多应用在基于微流控芯片的水污染生物监测系统中.这里按照所测定指标的不同,分别进行总结.

1.微藻生长分析芯片系统

水污染引起水体各种物理、化学条件的改变,这些改变直接影响到生活在水中的藻类的生长、繁殖.因此,藻类生长抑制(algaegrowthinhibition)是生物法监测地表水和地下水水质的基本参数.作者所在课题组设计并制作了一种集成污染物浓度梯度生成器和扩散式藻类培养单元的微流控芯片(图2)[51].该芯片以PDMS为基本材质,中间夹杂聚碳酸酯膜,可在线完成污染物梯度添加、微藻培养、受激和检测过程,极大地简化了藻类毒性试验操作过程.试验选取5种常见微藻,包括3种绿藻、1种硅藻和1种红藻,进行微流控芯片培养.结果表明,微流控芯片微藻培养显示了与实验室常规微藻培养类似的种群增殖曲线,从而首次证明了以PDMS材质微流控芯片作为微藻实验平台的可行性.同时,以青岛大扁藻(Platymonashelgolandicavar.tsingtaoensis)、亚心扁藻(Platymonassubcordiformis)、小球藻(Chlorella)和三角褐指藻(Phaeodactylumtricornutum)为受试对象,研究其在重金属胁迫下的表观增殖率的变化情况,显示了良好的剂量-效应关系.

图2海洋微藻培养及毒性筛选微流控芯片示意图及实物图

2.微生物自体荧光检测芯片

很多微生物具有内源荧光物质,可通过灵敏的激光诱导荧光技术来进行研究,从而获得关于新陈代谢状态的信息以及其他各种微生物中存在的信息.如叶绿素荧光技术,就是以细胞内叶绿素作为天然探针,以光合作用理论为基础,研究和探测生物光合生理状况及各种外界因子对其细微影响的新型活体测定和诊断技术,具有快速、灵敏、易行、对细胞无损伤等优点.

Podola等[52]研制了一种非选择性膜固定式微藻传感器芯片系统(图3A),该芯片以玻璃纤维板作为基底层,用来提供培养基和污染物,上面封接上双层赛璐珞膜,双层膜之间夹有12个圆微藻固定区域,并以常规IMAGING-PAM叶绿素荧光仪做为检测器.该芯片系统的优势在于可在12个区域固定不同微藻,利用其对于不同污染物敏感程度的差异,对污染物种类做出初步判断.其不足在于检测系统仍外围化,集成度不高.

图3微藻叶绿素荧光检测芯片

Lefvre等[53]在这方面工作中取得了较大的研究进展,制造了一种基于PDMS材质,集成了有机发光二极管(OLED)和有机光电探测器(OPD)的微流控芯片(图3B).以莱茵衣藻(Chlamydomonasrein-hardtii)为指示对象,检测水体中除草剂敌草隆,其检测限能低至11nmol·L-1.尽管该微流控芯片能在很低的浓度下对污染物进行监测,然而它在很多方面依然有改进和提升的空间:1)减少基片厚度,并集成显微镜头阵列,可以有效改善OLED和OPD之间的联系,并提高接受信号的质量;2)缩短OLED发射的波长,使其对海藻的刺激作用更有效率;3)采用对污染物敏感度更高的海藻,进一步降低检测限.

此外,Garca-Alonso等[54]开发出一种基于酵母荧光的微流控芯片.该芯片是利用酿酒酵母(Sac-charomycescerevisiae)暴露在基因毒素的条件下能表达出绿色荧光蛋白的性质,对甲基-甲磺酸盐进行了有效的检测.试验结果表明,每单位面积的荧光强度与甲基-甲磺酸盐暴露的时间呈正相关.

3.微生物活性的荧光分析芯片

微生物的细胞活性可以直接从细胞层面反映水污染状况,可利用外源荧光探针分析法进行测定.在这方面研究工作中,流式细胞术的出现起到了重要的推动作用,众多研究者以细菌和微藻为受试生物,结合多种荧光探针评价了重金属、农药和有机污染物的生物毒性。

由于流式细胞仪设备昂贵、体积庞大,难以适应现场要求.因此,作者所在课题组在微生物活性荧光分析芯片的研制方面做了积极的探索,设计并制作了一种基于PDMS材质的微流控芯片[51],尺寸为63mmX63mm,以荧光素二乙酸酯(fluoresceindiac-etate,FDA)为探针,测定重金属Cu胁迫下小球藻(Chlorella)和紫球藻(Porphyridiumcruentum)的酯酶活性,呈现出良好的剂量-效应关系.目前,该芯片系统仍采用外源检测设备,包括荧光倒置显微镜和CCD成像系统,因此,只适用于实验室研究.下一步工作的方向是检测设备,包括OLED和OPD的微流控芯片的集成,开发适于现场检测的小型化仪器.

在仪器集成化方面,Fukuba等[57]取得一定的研究进展.他们利用海洋中微生物活性与其所在环境中的ATP含量(包括溶解与未溶解的)密切相关的原理,使用荧光素-荧光素酶(luciferin-luciferase)体系,定量分析了海水中ATP的含量,以及在ATP数量下降时周围环境中微生物的消退状况.通过使用集成式原位ATP装置“IISA(integratedinsituana-lyzer)-ATP冶(图4A、B)进行分析,在2X10-12~2X10-8mol·L-1的范围内,ATP的检测限为1.1X10-11mol·L-1,通过在日本东京湾和冲绳岛的原位测试显示,ATP的含量分别为2.7X10-10和3.4X10-10mol·L-1.

图4集成式原位ATP装置

近些年来,随着各种分析和监测手段的发展,微流控芯片技术取得了巨大的进步.考虑到了解人类活动对生态环境影响程度的需求日益增加,越来越多的科研组织已经认识到微流控装置在环境监测和生态分析中的优势,并投入力量进行研发.

由于其低廉的造价以及易于操作等优点,微流控设备拥有巨大的成为便携式装置的潜力.我们认为,未来微流控分析装置的发展,将着眼于两个方面:一是生产功能高度集成的微流控芯片系统或简单易用的纸芯片,这样可以使更多没有经过专门培训的人员对微流控装置进行操作;二是与传统的分析设备相比,便携化依然是微流控芯片的最大优点.但是目前受技术限制,微流控设备在检测精度及抵抗外界因素干扰等问题上,与传统设备仍有一定的差距,这在某种程度上限制了微流控设备的使用.然后在应对诸如突发生态污染事故、或者需要大面积估计一个区域某项生化指标等情况下,微流控芯片仍具有相当的优势.科研人员现在正在努力在保持便携性的基础上,使微流控装置提高测量精度,并具有处理更加复杂样品的能力.

从目前的发展水平来看,微流控芯片已经突破了其发展初期在加工技术和基本流控技术上的主要难关,正在进入一个更深入的基础研究、广泛扩大应用领域及深度产业化的转折时期.在相关技术方面,比如材料表面改性、流体驱动与控制、试样反应与混合、接口技术、系统集成等方面,也取得了卓有成效的进展.从生态环境分析与检测的角度来看,现有技术水平的微流控芯片不仅可以监测并分析水环境中诸多不同类别的污染物,比如重金属、营养盐、有机污染物,以及有害微生物等,还可以对微藻数量、ATP含量等进行定量的分析.上述指标都可以从不同角度反映出水环境的生态状况,为进一步的研究提供第一手的数据.因此,可以预计的是,微流控芯片将在不远的将来取代当前分析实验室中的很多设备,并进入生产现场、监测区域等成为主流的污染监测和生态分析工具,使便携式“个人实验室冶成为现实.

文章来源：应 用 生 态 学 报 2014 年 4 月 第 25 卷 第 4 期 《微流控芯片在水环境污染分析中的应用》作者：王 虎 魏俊峰 郑国侠

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