微流控芯片应用于电化学阻抗生物被膜
生物被膜是细菌及其自身分泌的胞外聚合物组成的微生物群落，其形成是受多种机制共同调控的多阶段动态过程，具有较强的耐药性且难以清除，给医疗、食品等行业带来了巨大的威胁。
生物被膜是为适应环境而在有生命或无生命的物体表面形成的有组织的微生物群落。生物被膜可谓是细菌的天然保护屏障，为细菌提供了相对稳定的生存环境。生物被膜在自然界中广泛存在，对人类生产生活的各个方面都有重要影响。据统计，65%的医源性感染与生物被膜相关，生物被膜内细菌的耐药性是医疗行业所面临的重大难题之一。此外，生物被膜会引发水污染影响饮用水质，导致食品污染。
生物被膜的形成不是一蹴而就的，是一个细菌粘附到基质表面，并不断增殖分裂形成微菌落直至生物被膜发展成熟，最后生物被膜破裂细菌重新定植的多阶段动态过程。生物被膜的形成既受外界环境的影响，又受细菌内部基因的调控，群感效应作为细菌进行信息传递的重要机制，它在生物被膜的形成中起到了重要的调节作用。
1生物被膜的结构特点及形成过程
过去人们常认为细菌倾向以游离的状态存在，是以单细胞的方式生存，直到17世纪，VanLeeuwenhoek发现固着在牙齿上的细菌是以细菌群落的形式存在的，生物被膜的理论才逐渐被人们所认可[9]。生物被膜研究之父Costerton将生物被膜定义为由粘附在有生命或无生命表面上并包裹在自分泌的胞外聚合物的细菌组成的微生物群落[4]。生物被膜广泛存在于自然界中，其更倾向于形成在潮湿的物体表面，如食品加工设备、医疗器械等[10]。生物被膜可有效地保护其中的细菌，使得膜内细菌具有更强地抵御过酸过碱、高温、高渗透压等不利生存环境的能力和更强的耐药性，有利于细菌更好地适应周围环境。
生物被膜由粘附在物体表面的细菌及胞外基质组成。胞外基质主要指的是胞外聚合物(EPS)，它是生物被膜的主要化学成分，胞外基质也包含蛋白质、DNA等物质[13]。例如，铜绿假单胞菌生物被膜胞外多糖主要是Pel、Psl和海藻酸盐，eDNA也是铜绿假单胞菌生物被膜的重要组成成分，其作用是维持生物被膜的稳定性[14]。生物被膜不是细菌及胞外聚合物(EPS)的简单聚合，而具有复杂的架构。例如，铜绿假单胞菌及枯草芽孢杆菌生物被膜中点缀有开放的水通道，这些水通道有利于生物被膜中营养物质及代谢废物的交换[15]。
生物被膜的形成是个动态而复杂的过程。这一过程可划分为几个主要的阶段：可逆粘附期、不可逆粘附期、微菌落的形成、生物被膜成熟期以及散播期[16-17](图1)。在可逆粘附期，细菌通过鞭毛或菌毛可逆地粘附到物体表面，在这一时期细菌可以脱离表面重新回到浮游状态；之后细菌表面蛋白和胞外聚合物(EPS)协助细菌粘附到固体表面，可逆粘附转变为不可逆粘附[18]，粘附期是生物被膜形成的关键时期，它是细菌由浮游状态到生物被膜形成的转折点；随后粘附的细菌不断增殖分裂，胞外聚合物(EPS)逐渐增多，形成微菌落直到形成成熟的生物被膜，在成熟的生物被膜中胞外聚合物(EPS)占生物被膜干重的90%，胞外聚合物(EPS)把生物被膜中的细菌粘附在一起，维持着生物被膜的三维结构，使得膜内细菌具有更强的耐药性，以及抵御不良环境的能力，如增强生物被膜内细菌对环境中有害金属离子的抗干扰能力[19-20]，同时胞外聚合物(EPS)可积累群感效应信号分子、胞外酶、细菌次级代谢产物，为细菌提供了信息交流的场所[21]；最后，生物被膜内细菌从成熟的膜中逃离，成为浮游菌，重新定植到新的表面，到达散播期，散播期不仅是上一个生物被膜形成周期的结束，而且是下一个生物被膜周期的开始[22]。有趣的是，研究发现生物被膜的结构随外界环境的改变而改变，如铜绿假单胞菌在氧气充足的条件下形成的生物被膜呈“蘑菇状”，而在无氧条件下可形成三维“网状”结构的生物被膜[23]。
图1生物被膜形成过程示意图
2.微流控芯片应用于电化学阻抗生物被膜检测
微流控芯片可集成不同的生化功能单元及实现高灵敏度、高通量检测，具有样品需求量小、操作简便的优势，提供比常规体系更加稳定的微环境，其用于生物被膜的检测具有很大优势。将细菌引入到微流控芯片的微通道中，在微流控芯片电极检测区形成生物被膜，可对其进行原位阻抗检测。此外，微流控芯片允许在人为可控的条件下研究生物被膜的生长情况，为生物被膜研究及在线监测提供了良好的平台。在此，我们详细介绍了近几年来文献报道的利用电化学阻抗检测生物被膜的微流控芯片。
Ben-Yoav等[77]设计了由2个上下平行放置的氧化铟锡涂层电极(ITO)组装而成的微流控芯片装置，利用多聚物加工出椭圆形电解槽，在电解槽的底部和顶部分别留有矩形凹槽便于放置氧化铟锡涂层电极，分别在电解槽两侧打孔，便于向电解槽注入细菌培养液以及排除废液。将大肠杆菌菌液通入到该芯片中，完成细菌在氧化铟锡涂层电极上的粘附和形成生物被膜，再插入Ag/AgCl电极作为参比电极，与上下2个平行放置的氧化铟锡涂层电极构成三电极体系进行阻抗测试，利用等效电路模型分析了由大肠杆菌粘附及其生物被膜生长引起的电容和电阻的变化情况，发现培养0–23h电容值升高而电阻值下降，之后电容值下降而电阻值升高，电容及电阻值的变化情况与大肠杆菌生物被膜的生长发展过程密切相关(图3C)。
Zheng等[78]采用光刻技术在聚乙烯对苯二酸酯(PET)基质上先后蒸发溅射一层铬层和金层，制作出3个不同尺寸的金参比电极和5个不同尺寸的金工作电极，可通过改变工作电极和参比电极的尺寸大小和两者之间的距离，对电化学阻抗测试操作条件进行优化；之后将生物相容性良好、稳定性良好的聚吡咯(ppy)修饰到金电极表面，增强金电极对生物被膜粘附能力。将聚碳酸酯电化学流动池和包含电极的基质材料进行组装，实现外部培养基及菌液的注入，对铜绿假单胞菌的生物被膜进行了长达232h的原位阻抗信号监测，用等效电路模型进行拟合计算，发现修饰聚吡咯的金电极与未修饰的金电极相比，对等效电路中的电荷转移阻抗Rct具有更高的灵敏度(图3A)。
Pires等[79]设计了基于金电极阵列的多通道微流控芯片，该芯片由1条上游参比通道和1条下游测量通道构成，测量通道中4个相同的金工作电极可同时监测铜绿假单胞菌生物被膜的发展变化引起的阻抗信号，这既可减少因局部环境不同造成的实验误差，又可实现多通道的并行检测。他们利用此芯片对铜绿假单胞菌生物被膜进行了原位实时阻抗监测，并通过测试通道内电流随着培养时间的变化情况评估生物被膜内细菌的生活状态。此外，还评价了杀菌剂叠氮化钠的杀菌效果及对生物被膜的清除效果，由阻抗测试和电流测试结果，得出叠氮化钠有一定的杀菌效果，但不能完全瓦解已形成的生物被膜(图3B)。
近年来，在微流控芯片微通道里利用叉指微电极开展了基于电化学阻抗检测生物被膜的生长情况。Settu等[80]采用微机电加工技术将4个相同的叉指微电极集成到玻璃基片上，再使用硅橡胶粘合剂将聚苯乙烯腔体整合到基片上部，实现外部培养液及菌液的引入，对含大肠杆菌尿液样本进行了12h的监测，利用等效电路模型分析了随细菌培养时间延长所导致的阻抗信号的变化情况，发现Cdl随着培养时间延长显示出减少趋势，大肠杆菌的粘附及其生物被膜的形成是造成其变化的主要原因(图3D)。Estrada-Leypon等[81]设计了用于金黄色葡萄球菌生物被膜原位实时检测的微流控电化学阻抗芯片，该芯片基片包含两种叉指微电极、参比电极、对电极以及测试K+、Na+的PE电极，芯片盖片由聚二甲基硅氧烷(PDMS)材料制作，其中两种叉指微电极用于金黄色葡萄球菌生物被膜的阻抗测试。他们利用有限元法对矩形叉指电极的几何尺寸进行了优化，并将优化后的矩形叉指微电极与圆形叉指微电极获得的生物被膜阻抗信号进行比较，发现矩形叉指微电极的检测灵敏度得到了提高，并将显微观测技术与阻抗技术相结合，同时观测和检测金黄色葡萄球菌生物被膜的生长情况(图3F)。
图3微流控芯片电化学阻抗检测生物被膜实例
生物被膜的形成会受到周围环境因素的影响，如培养基、温度等，满足生物被膜生长所需培养基的流动状态也会影响生物被膜的结构[82-83]，在流动状态下形成的生物被膜与生物被膜造成感染的环境更加接近。利用微流控技术在流动状态下研究生物被膜的形成更有价值。Zarabadi等[84]将石墨工作电极及石墨参比电极剪切成长条状，再通过电沉积法制作金工作电极，将3个电极用双面胶粘合于硅基片上，将聚二甲基硅氧烷(PDMS)浇筑到模具上制作出微通道再与含3个电极的硅基片贴合，成功构建实验所需微流控芯片装置(图3E)。利用此微流控芯片装置分别对流动状态下微通道拐角及中心处铜绿假单胞菌形成的生物被膜进行了长达65h的在线监测，并采用等效电路模型对微通道拐角及中心处获得的生物被膜阻抗信号进行拟合分析，发现随培养时间的延长，微通道拐角及中心处拟合得到的生物被膜电容Cb均先增加后减少，生物被膜电阻Rb均呈现降低趋势，但相比微通道中心，微通道拐角处拟合得到的生物被膜电阻Rb较大，可能是由于两处形成的生物被膜结构存在差异。
综上所述，不同的细菌种类成膜能力及其形成时间会存在差异，电化学阻抗是通过获取生物被膜响应的阻抗信号进行检测，阻抗信号本身不具有特异性。但是，不同的细菌生物被膜响应的阻抗信号有所不同，我们可通过控制及优化阻抗检测的相关参数，由阻抗相关参数对不同种细菌形成的生物被膜进行区分。电极的材料构型及等效电路分析模型是应用电化学阻抗检测生物被膜的关键。相同细菌在不同的电极表面处生物被膜的形成情况也可能存在差异，对生物被膜检测具有高灵敏度且易于粘附细菌的电极材料及电极结构设计有待进一步研究。针对不同的生物被膜阻抗检测体系，会有不同的等效电路分析模型，且模型选择不同，拟合得到的生物被膜相关电容及电阻结果也存在差异。细菌生物被膜的形成过程分为可逆粘附期、不可逆粘附期、成熟期及散播期，处于不同时期的生物被膜具有不同的结构，因此不同时刻获得的生物被膜阻抗谱图呈现出规律性的变化趋势，等效电路拟合得到的生物被膜相关电容及电阻也会呈现出一定的变化规律，但目前的研究还未能清晰地由阻抗分析结果严格区分生物被膜所处的生长周期。所以今后，深入解析生物被膜特征阻抗信号并建立生物被膜与阻抗分析结果的关联模型是完善电化学阻抗检测生物被膜研究的一个重点。微流控芯片具有便携、易于功能化及集成化的特点，如何充分发挥微流控芯片本身的优势，并将其与电化学阻抗技术有机结合起来应用到生物被膜的检测及生物被膜形成机制的研究中，是今后具有特色的研究方向之一。
3.总结及展望
自人类认识到细菌不单是以个体的形式存在，还会以群体的方式即生物被膜的形式存在以来，生物被膜的研究就一直备受关注。生物被膜的形成既受到周围环境因素的影响，又受到细菌内基因的调控。细菌群感效应是一种调节生物被膜形成的重要机制。当前，生物被膜的检测方法显得尤为重要，它是解决由生物被膜引发院内感染及食品污染等问题的基础。结晶紫染色、激光共聚焦(CLSM)显微观测等方法虽可对生物被膜的结构进行表征，但不能满足对生物被膜动态形成过程的持续在线检测。此时，电化学阻抗以其无标、无损、原位持续在线检测的优势，应用到生物被膜动态形成过程的检测中恰到好处。在生物被膜阻抗检测中，电极的选择是决定检测灵敏度的关键，一方面，可对普通电极表面进行化学修饰以提高生物被膜阻抗信号响应灵敏度；另一方面，设计制作超灵敏微电极，并将微电极集成到微流控芯片中，合理布局微流控芯片功能区，即可提高生物被膜电化学阻抗检测灵敏度，又可发挥出微流控芯片本身的优势，以实现生物被膜形成过程的高通量检测。除此之外，微流控芯片微通道微环境中受外界干扰小，可对流体流速等条件进行人为操纵，具有模拟人体内环境的潜能,微流控芯片为电化学阻抗研究体内生物被膜在肺部、肠道等部位的感染及生物被膜形成情况提供了良好的操作平台。总之，将微流控芯片与电化学阻抗结合在生物被膜检测方面较常规体系具有很大优势。今后，用于生物被膜阻抗检测的高灵敏电极结构设计及电极修饰、满足生物被膜在不同环境下检测的微流控芯片设计是极具前景和重大意义的研究方向。
文献：刘露露 等《生物被膜的形成及其电化学阻抗检测》http://dx.doi.org/10.13345/j.cjb.170264
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