微流控芯片毛细管电泳在蛋白质分离分析中的应用研究进展

汶颢微流控毛细管电泳芯片

1.微流控芯片毛细管电泳的特点

芯片毛细管电泳技术将常规的毛细管电泳操作在芯片上进行，利用玻璃、石英或各种聚合物材料加工微米级通道，以高压直流电场为驱动力，对样品进 行进样、分离及检测。它与常规毛细管电泳的分离 原理相同，因此在分离生物大分子样品方面具有优 势。此外，与常规毛细管电泳系统相比，芯片毛细管电泳系统还具备分离时间短、分离效率高、系统体积 小且易实现不同操作单元的集成等优点 。芯片毛细管电泳的上述优点使其成为蛋白质分离分析中的重要手段之一。

Rodriguez等曾分别在常规毛细管、短毛细管和玻璃芯片上，以区带电泳的分离模式，对人免疫球蛋白 G（ IgG>）和荧光素异硫氰酸酯（FITC）的反应混合物进行分离，以比较3种系统的分离性能。 使用有效分离长度为35cm的长毛细管和有效分离长度为6cm的短毛细管时，其分离时间分别为335s和84s，理论塔板数分别为27750和 41816。 当使用有效分离长度仅为2.8cm的玻璃芯片时， 分离时间缩短至16s，理论塔板数达到49000。由此可以看出采用玻璃芯片进行毛细管区带电泳在分 离速度和柱效上明显优于常规毛细管电泳系统。

2.微流控芯片毛细管电泳分离蛋白质的模式

目前，报道的芯片毛细管电泳分离蛋白质 主要采用区带电泳、凝胶电泳、等电聚焦、胶束电动色谱及二维电泳等模式。

2.1芯片毛细管区带电泳

毛细管区带电泳是芯片毛细管电泳分离蛋白质的一种最基本的分离模式。它基于不同的蛋白质分子在电场中的迁移速率不同而实现分离，是一种简 单、快速的分离方法。采用区带电泳分离模式已成 功地分离了多种蛋白质样品。

在芯片毛细管电泳分离蛋白质的研究中所要解决的一个重要问题就是通道表面对大分子蛋白质的吸附问题。蛋白质与芯片通道内壁之间的微小吸附效应就会降低蛋白质的分离效率，引起峰形变宽拖尾，影响分离的重现性。在毛细管区带电泳分离模 式下，一般采用通道内壁永久改性和缓冲液中加入添加剂进行 动 态修饰两种方法来抑制蛋白质的吸附。

Wu等采用多层88%水解聚丙烯醇（PVA） 修饰PDMS芯片，以区带电泳模式有效分离了两种碱性蛋白质（溶菌酶和核糖核酸酶）以及两种典型的酸性蛋白质（ 牛血清白蛋白和β-乳球蛋白）。该涂层在ph3-11范围内均可抑制电渗流的产生和蛋白的吸附作用，并且效果稳定，连续运行70次后分离效果仍然很好。该研究组随后又采用自组装方法在PDMS芯片通道表面加工环氧修饰的聚合物涂层抑制蛋白质的吸附，成功地分离溶菌酶和核糖核酸酶A。

Chiem等在运行缓冲液中加入了无机电解质 ,NaCI和中性表面活性剂吐温20 来抑制蛋白质的吸附，利用芯片毛细管区带电泳进行了单克隆抗体的分离分析。

2.2芯片毛细管凝胶电泳

在蛋白质组学和蛋白质分离研究中，凝胶电泳是广泛使用的分离技术。它是以凝胶等聚合物作为分离介质，利用其网络结构并依据被测组分的分子体积不同而进行分离的一种分离模式。在芯片上采用凝胶电泳模式分离蛋白质，更有利于实现分离操作的高速度和高效率。Yao等［采用十二烷基磺酸钠（SDS）凝胶电泳分离模式，对比了芯片SDS毛 细管凝胶电泳与常规毛细管凝胶电泳系统分离蛋白质的性能，结果表明前者的分离效率明显优于后者， 分离时间也明显低于后者。

与常规毛细管凝胶电泳相同，芯片毛细管凝胶电泳常用的筛分介质也分为凝胶和非胶聚合物溶液两种。交联聚丙烯酰胺凝胶是广泛使用的一种凝胶筛分介质，Herr等首次将传统的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离蛋白质的方法移植到芯片上，采用光聚合的方法在芯片通道内制备浓度为6%的交联聚丙烯酰胺凝胶作为筛分介质，在30s的时间内对相对分子质量在6500~39000之间的 5种蛋白质进行分离，分离距离仅为4mm，分离效率达到理论塔板数 4.41x十的五次方。该研究组后期又在微通道内制备了浓度为 22%的交联聚丙烯酰胺膜用于蛋白质样品的预富集，有效富集了相对分子质量为（12000~205000）的蛋白质分子，并采用浓度为8%的交联聚丙烯酰胺凝胶作为筛分介质进行分离。

在芯片毛细管凝胶电泳中，通道内壁对蛋白质的吸附仍是需要解决的重要问题。Bousse等使 聚二甲基丙烯酰胺（PDMA）物理涂覆玻璃芯片微通道内壁，将电渗流降低， 以SDS凝胶电泳的分离模式在40s内分离了bio-rad公司的蛋白质标准样品，分离效率达到十的七次方塔板/M。Nagata在PMMA芯片中使用了PEG 涂层，以 5%线性聚丙烯酰胺为筛分介质，在分离长度为 3mm的通道内实现了胰蛋白酶抑制剂、牛血清白蛋白和β-半乳糖苷酶3种蛋白质的高速分离， 分离时间仅为8s。

2.3芯片等电聚焦分离

芯片等电聚焦分离蛋白质的原理与常规毛细管 等电聚焦基本相同，都是依据蛋白质的等电点（ pI） 不同而进行分离。Hofmann等首次将毛细管等电聚焦技术移植于玻璃芯片，应用于蛋白质分析。 Li等在PDMS芯片和聚碳酸酯（PC）芯片上，采用等电聚焦模式分离了牛血清白蛋白和增强型绿色荧光蛋白（EGFP）。Das等采用高聚物芯片，在等电聚焦电泳模式下优化了分离长度及电压条件， 最终在长1.9cm的通道内于1.5min内分离了绿荧光蛋白和R藻红蛋白，分离电压为500V。Cui等在 PDMS芯片上采用等电聚焦分离模式成功分离了重组绿荧光蛋白、异藻青蛋白和藻红蛋白。 该作者还报道，通过改变样品和分离介质中添加剂 甲基纤维素的浓度，可以改变完成蛋白质分离所需要的通道距离。

2.4芯片胶束电动毛细管电泳

胶束电动毛细管电泳是毛细管电泳与胶束增溶色谱相结合的分离技术，其原理是在装有胶束溶液的通道内，溶质组分在电场力的作用下根据其在胶 束相和水相之间的分配不同而产生分离。Jin等在玻璃芯片上采用胶束电动色谱的分 离模式，以 Bio-Rad 公司的CE-SDS缓冲液作为分离介质，成功实现了相对分子质量在 14400~200000之间的8种蛋白质的分离。Doud等采用 Brij35修饰PDMS 芯片通道，在胶束电动色谱的分离模式下实现了葡萄糖氧化酶和肌红蛋白的有效分离。该芯片涂层在ph2~6范围内可显著降低蛋白质大分子的吸附， 并减少检测蛋白质所需的冲洗时间，从而提高分离效率。Huang等在 PDMS芯片中采用0.1% 十二烷基麦芽糖（DDM）和 0.03%SDS作为混合胶束，对通道进行动态修饰，有效地抑制了蛋白质的吸附，控制了电渗流，使蛋白质在非变性条件下得到有效分离。

2.5芯片二维电泳分离

芯片毛细管电泳应用的成功促进了高速高效的 芯片二维电泳技术的发展。对于多组分的复杂蛋白 质样品，采用传统的一维分离方法通常无法满足要 求，需要采用二维分离技术来提高分离效率，增加峰 容量。与传统的毛细管电泳系统相比，在芯片上进行二维电泳分离，可以通过设计芯片通道结构实现 通道的直接交叉或连通，而无需制作复杂的二维毛细管电泳接口，从而避免了因在接口处存在死体积 而导致的谱带扩展现象。

在芯片二维电泳分离蛋白质的研究中，第一维分离模式多采用等电聚焦模式。Chen等制作了二维毛细管电泳PDMS芯片，利用第一维的等电聚焦和第二维的凝胶电泳对荧光标记的牛血清白蛋白和碳酸酐酶以及德科萨斯红标记的卵清蛋白进行分离分析。Li等设计了等电聚焦和凝胶电泳联用 的二维分离高聚物芯片。蛋白质样品在完成第一维的等电聚焦分离后，可在多个并行的通道内完成第 二维的凝胶电泳分离。整个分离过程在 10min内完成，峰容量达到1700。Herr等研制了采用十字通道构型的等电聚焦,自由区带电泳二维芯片系统，芯片通道宽200微米深20微米，待测样品在横向通道中进行等电聚焦分离，分离后的样品区带在电场驱动下进入纵向区带电泳通道中进行第二维分离。系统采用荧光显微镜成像的方法对分离性能进行了评价，5min内分离的峰容量达到1300。Wang 等通过在PDMS芯片中制作微阀来防止一维等电聚焦和二维凝胶电泳系统之间的分离缓冲液相混合，在20min内有效分离了4种标准蛋白质。也有报道在PMMA 芯片上进行SDS凝胶电泳和胶束电动毛细管电泳相结合的蛋白质二维电泳分离。 该系统在12min内完成10种蛋白质的分离，峰容量约为1000。

2.6芯片自由流电泳

除上述分离模式外，芯片自由流电泳也是芯片电泳分离蛋白质的重要方法。芯片自由流电泳是指在芯片中通过外加电场使样品随缓冲液连续流动的 同时沿电场方向进行电迁移，从而按照电泳淌度不同实现分离的电泳分离模式。,Raymond 等采用芯片自由流电泳模式分离了人血清蛋白、缓激肽和核糖核酸酶A，其分离长度为3.1cm，流出时间为62s。Kobayashi等采用自由流电泳的分离模式 在一个体积为56.5mmx35mmx30微米的微分离室（60微升）中实现了持续的蛋白质分离，并用羟丙基甲基纤维素涂覆来抑制蛋白质吸附，在25min 内有效分离了细胞色素C 和肌红蛋白。最近，Kohl-heyer等制作了一种自由流等电聚焦分离蛋白质的玻璃芯片，成功地将人血清白蛋白（pI=4.4）与等电聚焦标记物（pH3和9）分离。

微流控芯片毛细管电泳系统应用于蛋白质的分离分析具有突出的优越性，特别是在临床检验及现场监测等方面的应用具有良好的发展前景，同时，其对分析仪器的集成化、微型化与便携化的发展也具有重要意义。据文献报道，Renzi等已经研制出手持式的微流控芯片电泳分离蛋白质装置。该装置由电泳芯片、小型激光诱导荧光检测系统以及高压电源等组成，其体积仅为11.5cmx11.5cmx19.0cm，可用于现场分析、床旁医学诊断以及取证 分析。近年来，国内已有关于利用芯片毛细管电泳进行临床尿蛋白和脂蛋白检测的报道。最 近，Pandey等使用 Caliper公司和Agilent公司的P200蛋白质芯片来检测微量的白蛋白尿，将蛋白质的电泳分离和荧光检测集成化、自动化，实现了其在临床实验室的应用。

目前，很多科研工作者正致力于微流控芯片毛细管电泳与质谱联用技术的研究，以进一步提高系统对复杂样品的分离分析能力。上述系统在蛋白质分离分析及蛋白质组研究中有广阔的应用前景。尤其是对于复杂蛋白质样品的多维分离分析，芯片毛细管电泳以其快速高效的特点，可以作为其中的一维分离方法，显著提高蛋白质的分析通量。相信随 着研究的不断深入及相关技术的不断发展，微流控芯片毛细管电泳蛋白质分离技术将日趋成熟，在生化分析、临床诊断和蛋白质组研究领域发挥重要的作用。（文章节选来源：浙江大学微分析系统研究所 文章编号：1000-8713（2008）03-0269-05 转载仅供参考学习及传递有用信息，版权归原作者所有，如侵犯权益，请联系删除）