基于微流控芯片技术的CTC检测新方法

循环肿瘤细胞（CTC，Circulating Tumor Cell），即肿瘤在生长过程中，向血液循环中释放的各类肿瘤细胞的总称，是导致肿瘤扩散的关键因素。

CTC从肿瘤病灶脱离后进入外周血随血液流动，沿着血流方向来寻找合适的“土壤”来生长，最后要么被毛细血管截留或者粘附在血管壁上，要么就在外周血中循环最后被清除，只有极少数目的 CTC能附着在血管壁上，重新穿过血管，到达新的“土壤”，适应环境后成长为新的肿瘤。

CTC是一种生物标志物（biomarker），这是目前临床研发与应用的重点，是被寄希望用于癌症预后、分期诊断、疗效监控、复发预测、用药指导、早期检测等的标志物。与经典组织活检相比，具有肿瘤分子信息全、侵入性小、取样方便、成本低等优势。

CTC检测的最大困难在于其在外周血中含量稀少，通常1 mL外周血中含有109个红细胞，106个白细胞，而可能只含有1-10个CTC，在如此庞大复杂的正常细胞背景干扰下，比如巨核细胞、内皮细胞，未成熟的造血细胞，上皮细胞等，很难实现高灵敏、高特异的CTC 捕获检测。

尽管目前市场有各种各样用于分离及检测CTC技术，但由于缺乏必要的敏感性，它们的临床应用并不被广泛采用，大多数技术往往受到捕捉性的限制，在捕获的高效率与高纯度之间难以进行权衡。现在已经使用的微型柱和人字形结构成功的证明可以增加细胞和免疫表面相互作用，提高捕获效率，可遗憾的是，这种增强的相互作用是非选择性的，与非靶细胞相互作用的均等性机会将导致最后捕获的CTC纯度并不是很高。

研究者开发的基于流体力学分离与免疫识别的CTC捕获富集芯片（SDI-Chip）技术，其内构建了成千上万个表面修饰有抗体的微柱阵列，微柱阵列排布方式根据确定性侧向位移分离原理设计，CTC因尺寸较大将沿微柱偏移方向运动并不断与微柱碰撞而实现特异性识别捕获，而血细胞因尺寸较小将沿液流方向运动且很少与微柱碰撞而避免非特异性吸附。该设计有效地结合CTC在物理性质及表面标志物与背景细胞的差异，实现了CTC的高效、高纯度协同捕获。通过对大量临床肿瘤病人外周血样品的测试，该研究者验证了所发展的芯片技术在肿瘤分期诊断、疗效监控等方面的潜在应用价值。

SDI-Chip由两个镜像一样的包被上皮细胞粘附分子抗体（EpCAM）的微柱阵列组成，中间有一个样品入口，并有上下两个缓冲区入口（图1）。

通过计算流体动力学（CFD）用于对不同几何形状进行排序，并进一步优化微柱的布置，与圆形和椭圆形微柱相比，三角形微柱提供更高的相互作用概率和较低的剪切应力（图2）。

为了可视化流动模式和细胞与微柱的相互作用，研究者开发了一个模拟将CFD与固体力学相结合的模型，将不同尺寸的球形颗通过路上的微柱，然后粒泵送到出口，见图3

大于临界直径（Dc，13μm）的颗粒在与之相互作用的过程中被迫偏转离并交叉流线于微柱。由于每一列微柱被安排的与上一行偏离，大颗粒不断与每一个微柱相互作用，导致流动形成了偏斜角。相比之下，小于Dc的粒子仍然以原始流线运行，并减少与微柱的相互作用。模拟结果使用聚苯乙烯（PS）珠证实了实验观察到相同的流动模式。

总体而言，发现了20μm微粒的相互作用概率大于95％，10um微粒相比有显着提高，相互作用仅有5.5％。结果证明，SDI-Chip可以选择性地增强大颗粒与微柱相互作用。由于CTC的大小通常大于血细胞，这样的大小选择性相互作用可以高效率和高纯度的免疫捕获CTC。

图5E.以顺时针旋转一个三角形的微柱，到15o在它的轴线周围提供了一个更光滑的水动力梯度不影响细胞流动模式的力量。

图5F. 由于流体的影响，水动力的梯度下降与旋转的三角形微柱的斜坡相互作用产生增加了粘附力的梯度。因此，每个相互作用，ctc迁移到一个水动力区域减小梯度，致使流速减小，导致与免疫组织微量柱接触的持续时间延长。

图6. 在微柱旋转过程中剪切应力和在三角形微柱表面捕获的细胞分布

SDI – Chip进行了传统软光刻技术优化，后表面改性，抗体固定化和浓度优化，捕获芯片的性能验证使用了EpCAM-阳性SW480悬浮液细胞作为靶细胞（1000细胞/ml），293T细胞（EpCAM-阴性/罕见表达EpCAM）的悬浮液细胞和白细胞（WBCs）（106细胞/ml）作为对照细胞，通过50μm的最佳通道深度和流量为1ml/h的设备进行检测。

图7. (A)表面化学改性和EpCAM抗体固定过程的示意图。(B)显微照相荧光标记靶(SW480)细胞在缓冲或血液中分散，对照细胞(293T和WBCs)与免疫球蛋白SDI-Chip的结合。(C)和(D)显微摄影显示荧光标记SW480细胞的近视野。

通过在Buffer中掺入SW480细胞，SDI– Chip的捕获效率为99.2±3.5％，纯度为92.4±4.6％（图8C），同时研究者也展示了SDI芯片的临床潜力，使用血液样品进行细胞的捕获实验，通过将1000个SW480细胞加入1mL健康血液中来制备供体的血液。平均捕获效率和纯度分别为92.2±6.4％和82.3±3.8％（图8D）。如此高的捕获效率和纯度是归因于基于DLD原理的免疫接种相互作用。此外，具有由旋转提供的流体动力的梯度，在微柱表面上延长接触时间，三角形微柱也被认为有助于提高捕获效率。此外，靶细胞等血液细胞流向芯片的空间不同的区域，这可以减少目标细胞的竞争性脱落并确保在高细胞背景下存在高捕获效率。

剪切力的流体动力学梯度围绕旋转的三角形微柱产生（图9A）允许根据其抗原来描述捕获CTC微柱周围的表达水平。细胞表达较高表面抗原量的CTC形成较强可以抵抗由于剪切而产生的移动力的结合，并且被捕获在三角形微柱的顶端附近。另一方面，表达细胞表面抗原相对较少量的CTC不会形成足够强的抵抗力脱落力，因此，他们将沿着斜坡向下移动（较低的剪切应力面积），直到它们形成足够牢固的粘结以抵抗该地区的流体动力。

捕获的SW480细胞使用微透镜观察使用荧光标记的EpCAM抗体染色的CTC，来评价EpCAM表达水平荧光强度（图9B）。与低细胞的荧光强度相比，荧光强度较高的细胞被发现被捕获在剪切应力的区域相对较高。这样的空间解决捕获使我们能够评估在芯片中捕获的CTC的抗原表达水平，通过观察CTC围绕微柱的捕获位置及抗原进行其他下游分析。

在SDI- Chip的免疫染色后，采集CTC和白细胞的样品显微图（图10）：

用EpCAM、CK、CD45抗体、DAPI对SDI- Chip进行免疫染色后，采集CTC集群的样品显微摄影（图11）：

国内液体活检产业正在如火如荼的蓬勃发展，各种技术都在日新月异的变化，无疑会带来更多市场格局的变化，从研究到临床转化研究再到临床应用，是一个漫长而严谨的道路，希望CTC技术能够早日成熟，造福于更多的肿瘤患者！

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