芯片液相色谱技术进展

微型化是现代分析仪器发展的重要趋势。微型化液相色谱仪器在提供与常规尺度液相色谱相同甚至更高分离效率的同时,可以有效减少溶剂和样品的消耗;在液相色谱-质谱联用中,低流速进样可以有效提高质谱离子源的离子化效率,提高质谱检测效率;对于极微量样品的分离,微型化的液相色谱可以有效减少样品稀释;液相色谱的微型化还有利于液相色谱仪器整体的模块化和集成化设计。芯片液相色谱是在微流控芯片上制备色谱柱并集成相应的流体控制系统和检测系统。芯片液相色谱是色谱仪器微型化的一种重要方式,受到学术界和产业界的普遍关注,但是这一方式也充满挑战。液相色谱微流控芯片需要在芯片基底材料、芯片色谱柱的结构设计、微流体控制技术、检测器技术等方面做出创新,使微流控芯片系统适配液相色谱分离技术的需要。目前芯片液相色谱领域面临的主要问题在于芯片基底材料的性质难以满足芯片液相色谱进一步微型化和集成化的需求;因此芯片液相色谱在未来的发展中需要着重关注新型微流控芯片基底材料的开发以及微流控芯片通道结构的统一设计。该文着重介绍了芯片液相色谱技术近年来的研究进展,并简要展示了商品化芯片色谱当前的发展情况。

微型化已成为现代分析仪器发展的一个重要趋势。微型化的分析系统可以有效地减少样品和试剂的消耗,提高检测效率,降低检测成本。作为重要的分离分析手段,色谱仪器的微型化也是分离科学未来发展的重要趋势。从色谱仪器的角度看,微型化可以带来的优势包括: (1)溶剂消耗量的大幅减少,理想状态下相较于常规色谱系统可减少溶剂消耗近3个数量级;(2)样品需求量下降,适合生物组学研究等无法获得大量样品的分析领域;(3)快速的分离分析;(4)有利于色谱装置的模块化、集成化设计。此外,在液相色谱-质谱联用中,由于电喷雾离子源(ESI)的离子化效率与前端色谱流速的倒数具有线性关系,色谱微型化带来的低流速可以有效适配ESI-MS,适用于分析生物组学研究中常见的微量复杂样品。

基于微流控芯片平台的液相色谱被称为芯片液相色谱。得益于微机电技术(MEMS)强大的微结构加工能力,相较于另一类微型化色谱——毛细管液相色谱,芯片液相色谱具有更高的灵活度和可集成性,在微型化、模块化、智能化、自动化等方面,芯片液相色谱具有更好的发展前景。目前,芯片液相色谱可以良好地实现常规液相色谱的富集、分离等功能,产业界也在芯片液相色谱商品化上取得一定成果。本文将着重介绍近年来芯片液相色谱技术在学术界和产业界的最新进展,并展望芯片液相色谱技术未来的发展方向。

1 芯片色谱系统

芯片色谱系统的设计、加工、使用是一个复杂的系统工程。根据具体分离任务的需要,芯片基底材料的选择、色谱固定相的选择、芯片通道结构的设计与制造、流体驱动方式以及芯片连接方式的选择、检测器的选择与联用、特殊色谱结构或方法的联用,各个要素相互影响、相互牵制,每一个要素都具有重要的作用。

1.1 芯片基底材料

芯片基底材料的选择需要综合考虑材料的特性(硬度、形变模量、化学惰性、吸光性质、吸脱附性质、生物兼容性等),并根据所拥有的加工手段以及分离分析的具体条件来决定。最早使用的芯片色谱基底材料是硅。由于早期微流控芯片加工工艺大部分直接继承自微机电加工技术,硅自然成为工程师们最为熟悉的芯片材料。硅材料具有较高的硬度和良好的化学惰性,适用于绝大多数色谱方法,因此硅在早期芯片液相色谱领域内有很多应用。但是,硅在紫外以及可见光区无法透射,这导致在硅芯片上直接原位使用光学检测较为困难。因此,人们常用玻璃或石英材料替换硅。玻璃以及石英具有出色的化学稳定性、机械强度、优良的生物兼容性和可衍生能力,同时还具有极高的透射率。Belder课题组在玻璃芯片上开展了系统性的工作。他们设计了一整套标准化的玻璃芯片器件(见图1a),这些芯片结合了液相色谱分离与ESI离子源,并配备了高压不锈钢夹具用于芯片与外部设备的连接。这种高压不锈钢夹具可以承受高达36 MPa的流体压力,同时还可以实现极低死体积(约2~10 nL)的侧向芯片连接。Mellors等设计了一种毛细管电泳芯片并与ESI-MS联用,他们将矩形芯片的一个角直接作为ESI喷口,证明了玻璃芯片可以直接作为ESI离子源的喷口。利用玻璃对高温的耐受性,Heiland等开发了具有温度梯度洗脱功能的玻璃色谱芯片,并用于分离多环芳烃。这种温度梯度芯片可在以4 ℃/s的温度梯度升温至200 ℃的梯度条件下工作。该课题组还利用玻璃材料优良的稳定性和机械强度,在同一套玻璃芯片的基础上开发了芯片超临界流体色谱(supercritical fluid chromatography, SFC)联用双光子激发(two-photon excitation, TPE)荧光光谱装置。这一装置可在20 s内完成色谱分离,且在20 mm/s的高流速下仍能得到高度对称的色谱峰。

图 1   芯片色谱基底材料

与硅和玻璃材料相比,聚合物基底材料具有更良好的加工性能,是目前微流控芯片领域最常用的芯片基底材料。基于聚合物材料,人们已发展了丰富的加工技术,如激光烧灼技术、软光刻技术、喷射造型技术等。这些稳定且成熟的物理加工手段使得聚合物芯片具有较高的批次间重现性。然而,聚合物芯片在化学稳定性和机械强度方面,要普遍逊色于石英芯片和玻璃芯片。聚二甲基硅氧烷(PDMS)是目前应用最为广泛的聚合物微流控芯片材料,PDMS具有优良的透光率和生物兼容性。同时,PDMS还极为柔软(弹性模量约为500~4000 kPa),只需要施加一个大气压的压力就可以引起PDMS一个维度上近10%的形变。这使得PDMS相比玻璃芯片可以更容易地实现芯片与其他设备的连接,甚至可以在PDMS芯片通道内直接加工泵阀结构。但PDMS的缺点亦十分明显: PDMS材料在常用的色谱流动相溶剂中易发生溶胀;其较强的吸附性质和透气性会导致较严重的色谱峰展宽;低弹性模量使得PDMS芯片无法承受高流体压力,不适合高效液相色谱这类流体背压较大的色谱方法。以上诸多问题使得PDMS材料在芯片色谱领域内的应用受到较大限制。但PDMS作为极易加工和批量生产的芯片材料,在微流控领域常作为原型设计使用。热塑性材料(thermoplastics)的高分子链结构更加紧密,在加热到玻璃化转变温度时热塑性材料会由固态转变为具有一定流动性的状态,其冷却后会固定形态的性质称为热塑性。热塑性的芯片材料有:聚碳酸酯(PC)、聚甲基丙烯酸酯(PMMA)、环烯烃共聚物(copolymers of cycloolefin, COC)等。相比于以PDMS为代表的弹性体(elastomer),热塑性材料具有更高的机械强度(如PMMA弹性模量可达3.2 GPa)、更强的抗溶剂腐蚀性能和更优良的可加工性。Wouters等开发了基于COC的高效液相色谱芯片系统(见图1b),他们利用微铣削技术直接在COC基底上铣出芯片通道,通过溶剂-真空辅助键合技术封装芯片,配合特别设计的芯片接口制成在38 MPa压力下可长时间运行的COC液相色谱芯片,并利用这一系统完成了烷基苯酮的快速分离。还有一些特殊的芯片基底材料,如钛、陶瓷、钻石等,基于它们极高的机械强度、极强的耐腐蚀性能、极高的热稳定性等原因,也被尝试应用于芯片色谱基底材料。但由于它们较为苛刻的加工和制造条件,目前这几类芯片基底材料还没有被大规模的应用。

1.2 芯片色谱柱

最早投入使用的芯片色谱柱结构是开管柱(open-tube)。开管柱床的制备是在色谱柱通道内壁上修饰硅烷、凝胶、聚合物等作为固定相。开管柱因其中空的柱床结构而具有最小的分离阻抗,开管柱床可以相对容易地在芯片孔道内实现。但其中空的结构也导致开管柱的柱床比表面积低,相比低,色谱柱容量小。提高开管柱柱容量的关键是提高固定相层的比表面积。Collins等利用光引发聚合反应在毛细管上可控地生成聚合物开管柱床(见图2a),所获得柱床厚度的相对标准偏差在±0.8%,实现了高度可控的开管柱床制备。Yang等在制备柱床时,将聚合物前体与商品化的色谱填料颗粒混合注入刻蚀好的柱管,之后用紫外光引发聚合反应。生成的聚合物层将填料颗粒包裹并固定在管壁上形成柱床。这些工作在一定程度上改善了开管柱的上样量,但仍无法从根本上解决开管柱的柱容量问题。

图 2   芯片色谱柱床电子显微镜照片

填充柱床(packed bed)是将预先制备好的固定相填料颗粒通过流体带动填装进色谱柱管形成的色谱柱床。填充柱具有显著优于开管柱的比表面积。由于柱管内充满填料颗粒,填充柱流体背压通常可以达到5~40 MPa。得益于色谱固定相技术数十年间的发展,填充柱拥有种类和功能都十分丰富的色谱固定相库可供选择。在微流控芯片上制备填充床需要解决两个问题:(1)如何将填充颗粒固定在芯片孔道内;(2)如何提高填料装填的重现性。固定填料颗粒常用的方法是在微流控芯片通道内构建柱塞(frit)结构。柱塞结构可以通过微加工手段制得,也可以利用原位聚合反应制备聚合物柱塞。Thurmann等利用激光辅助的光聚合手段在芯片通道中原位聚合生成一段约100 μm长的多孔聚合物整体柱塞。之后进行颗粒填料装填形成色谱柱床,最后在柱床末端再聚合制备一段柱塞完成色谱柱床两头的固定。这种不到100 μm长的多孔聚合物整体柱塞能承受25 MPa的装填压力,可以很好地满足芯片柱装填和使用的承压要求。Huft等利用PDMS的柔性,设计了一种多层PDMS多柱液相色谱芯片,并应用于免疫球蛋白基因逆转录PCR扩增产物的分离纯化。这一芯片通过微阀挤压芯片孔道形成局部锥形结构,利用基石效应(keystone effect)将色谱填料固定在柱管内。同时,他们还在芯片柱管壁上加工了大量微型旁路阵列,极大地减小了装填时的阻力,可有效辅助填料在PDMS孔道内的装填。旁路阵列在进行色谱分离时会通过微波照射封闭,不影响正常的色谱分离。本课题组的单颗粒柱塞技术也被运用到芯片填充柱的制备上。单颗粒柱塞是一种多孔的硅球颗粒,其颗粒尺寸略大于分离通道尺寸,此前常用于各类毛细管色谱柱的制备。使用时,只需将单颗粒直接塞入通道即可形成柱塞,使用方便可靠。Li等将多孔的单颗粒柱塞安装进入芯片通道内用于固定填充柱床,制备好的芯片柱可在约34.4 MPa的高压下工作。该芯片可在5 min内完成3种单胺类神经递质的分离,理论塔板数达到100000块/米。柱塞结构并非固定柱床的唯一方法,另一种方法是基于纳米微球颗粒自组装形成填充柱床。Shaabani等将甲基丙烯酸-2-羟基乙酯(HEMA)和二甲基丙烯酸乙二醇酯(EDMA)、光引发剂、致孔剂以及二氧化硅纳米颗粒混合后注入PDMS芯片的通道。通过光引发使HEMA和EDMA聚合,聚合过程中二氧化硅纳米颗粒发生自组装相互交联形成胶体自组装(colloidal self-assemble, CSA)柱床(见图2b)。该芯片在7天时间内进行28次蛋白质分离实验,蛋白质的洗脱时间相对标准偏差小于0.83%,芯片分离能力稳定。同一蛋白质片段在不同芯片(3片芯片)间洗脱时间的相对标准偏差为4.3%,芯片间也有较好的重现性。纳米填料颗粒自组装形成的柱床具有较高的重现性,且对装柱技术要求较低。但由于纳米颗粒粒径极小,导致柱背压极大,因此除了电色谱方法外,其他液相色谱方法难以在纳米颗粒自组装柱床上使用。

整体柱床(monolithic bed)是一种通过聚合反应在色谱柱管内原位合成的固定相结构。相比于填充柱,整体柱的流阻较小,且不需要柱塞结构来固定柱床。相比于开管柱,整体柱具有更高的比表面积和柱容量。其原位聚合的模式也使整体柱在芯片色谱领域的应用备受关注。整体柱床主要的缺陷是: (1)聚合反应可控性较差,柱间重现性较难保证;(2)聚合反应的化学环境对芯片材料的选择有限制;(3)在聚合反应前后,整体柱床的尺寸常发生一定“缩水”,容易导致柱床脱落。Kendall等开发了一种非原位的整体柱床制备方法。他们首先在一个芯片模具中制备整体柱床,之后拆开模具芯片并取出柱床。在对柱床做衍生化处理后,再将其放入一个通道尺寸缩小10%的芯片,最后封闭芯片完成制备。这种制备方式虽然失去了整体柱原位聚合的优点,但换来的是尺寸更加可控的整体柱床制备。在解决柱床收缩问题的同时,还可以实现不同功能化的柱床联用,实现多维分离。除了常见的有机聚合物整体柱床,无机材料也被应用于芯片整体柱的制备:Zhai等开发了一种基于氧化石墨烯硅烷聚合物的分子印迹整体材料芯片色谱柱(见图2c),并用于分离富集辣椒粉中的罗丹明B。他们将氧化石墨烯(GO)与3-氨丙基三乙氧基硅烷耦联生成氧化石墨烯硅烷(GO/SiO2),之后通过交联剂乙二醇二甲基丙烯酸酯(EDMA)与GO/SiO2反应生成整体柱床。该芯片色谱柱对罗丹明B富集因子可达110,检出限为0.40 ng/g。

柱阵列柱床(pillar array bed)是芯片色谱独有的柱床结构。柱阵列柱床的原型是一种被称为COMOSS(collocated monolithic support structure)的微流控芯片结构。这种结构由大量规则排列的微柱组成,通常是通过光刻结合深反应离子刻蚀(DRIE)技术加工制成。基于物理加工手段的制造方法使得柱阵列柱床具有极高的重现性,并且可以批量复制。单纯的COMOSS结构比表面积较低,样品载量低,作为色谱柱床使用需要对微柱阵列进行额外的修饰。Lincoln等研究了在柱阵列表面修饰多孔层的厚度对柱效以及保留时间的影响。多孔层厚度的增加对理论塔板数的提升较小,但保留性能会有明显的增加。同时,极大提高的比表面积也对柱阵列柱床的载样能力有显著提升。Desmet课题组对柱阵列色谱(pillar array chromatography, PAC)技术的成熟完善以及应用做了较为系统的工作(见图2d),包括:柱阵列色谱柱的制备、流体动力学模型、柱阵列多孔层研究、柱阵列长柱制备等方面。尤其在柱阵列芯片色谱长柱制备上,Desmet课题组做出了系统性的工作。Baca等利用串联4张柱长为2 m的柱阵列色谱芯片得到的8 m长的柱阵列色谱柱分离小分子混合物,在2050 min的梯度时间内得到了1815的峰容量。由于柱阵列的结构特点,相比于8 m的柱长,该串联芯片组可以在较低的流体压力(25 MPa)下以0.60 mm/s的线速度完成分离。

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