芯片液相色谱技术进展（下）

1.3 流体控制

芯片色谱是以微流控芯片作为载体的色谱系统,其核心-微流控芯片的关键功能就在于流体控制。高效的微流体控制是芯片色谱正常工作的基础。进样是色谱分析极为重要的一个步骤。进样量过大会导致进样时间过长、色谱柱过载、峰展宽等问题,严重影响色谱分离的效率。目前与高效液相色谱配套的进样针的规格普遍在微升级别,而芯片色谱平台需要控制纳升级别的进样量。因此,开发与芯片色谱相匹配的进样系统显得十分重要。芯片色谱进样技术大致可分为电动进样与压力进样两类。其中,电动进样无需泵阀结构、操作简单的特点使其成为最早投入使用的方法(T型和双T型电动进样通道),同时也是目前最常用的芯片色谱进样模式。Cong等开发了一种电动阀门式的芯片色谱进样结构(见图3a)。这种结构中有一个电驱动的可变型阀门,阀门两侧分别是进样通道和色谱柱。在准备阶段,在样品通道与色谱通道两端施加电压,样品先进入样品通道,并由于阀门阻挡无法进入色谱柱。在进样阶段,阀门脉冲开关打开,样品定量进入色谱通道,之后阀门关闭并开始色谱分离。电动进样由于扩散、迁移率等问题,通常进样误差很大,很难做到定量进样。相对的,基于机械手段推动样品的压力进样方式可以实现高精度的定量进样。但由于需要对流体额外施加压力,压力进样需要更多泵阀结构提供支持。压力进样也可以通过分流的操作方式摆脱泵阀结构,从而实现简单的定量进样。Gáspár等在PDMS芯片上设计了一种分流进样结构,由进样口注入分流区的样品会依据分流结构各通道的宽度比进行分流。通过控制进入色谱柱的通道与其他分流通道的比例就可以将进样量精确地控制在纳升级。但需要指出,分流式压力进样需要较大的样品量,且不可避免地会造成样品浪费。Ha等开发了一种特殊的“穿刺”进样方法,他们直接将微升级的进样针扎入PDMS芯片的通道中,之后用千分尺调节进样针筒活塞位置实现“穿刺进样”。由于千分尺精确的距离调节,这种进样方式可实现3 nL体积的精准可重复进样,且非常廉价、使用简单。

图 3   芯片色谱流体控制措施

芯片色谱泵可简单分为芯片外置泵和芯片内置泵。早期芯片色谱泵直接沿用高效液相色谱设备使用的常规高压泵。但由于芯片通道尺寸减小,这些常规泵在进行梯度分离时会发生严重的梯度滞后现象。因此,常规泵需要加入分流装置来调整流速,以适应芯片色谱的工作条件。但分流在梯度分离中会造成严重的溶剂浪费,因此芯片色谱需要与其匹配的低流速高压泵系统。在芯片外置泵中,能够同时实现低流速和高压力的最简单的泵类型就是注射泵。Grinias等通过阀门切换梯度储存流路与UPLC泵和气动放大泵的连接实现了一种高压注射泵结构。在准备阶段,常规UPLC泵与梯度储存流路相连,配制好的流动相被注入梯度储存流路并保存在其中。在色谱分离阶段,切换阀门使装载有流动相的梯度储存流路与色谱柱相连,启动与梯度储存流路相连的气动泵,使储存的流动相以一个较高的压力注入色谱柱中完成分离。这一泵结构可以达到300 MPa的运行压力。芯片内置泵的驱动方式以电驱动、电渗流和磁驱动为主,虽然也存在芯片内置机械泵,但蠕动泵、气动泵结构在芯片上的加工难度较高,应用实例很少。最具代表性的芯片内置泵是电渗泵(electroosmotic pumps, EOP)。EOP有如下几点优势:

(1) 可直接集成到微流控芯片上;

(2) 可生成无脉冲液流;

(3) 可快速改变液流大小和方向;

(4) 没有运动组件,可有效提高泵的稳定性和寿命;

(5) 在较大的背压范围内都可产生中低流速液流。

Wang等开发了一种高压EOP芯片,该芯片泵的工作压力约17 MPa,工作流速约为500 nL/min,该条件已足以支持芯片液相色谱的运行。该芯片由大量EOP基本单元组成,每个EOP基本单元由数个电渗通道并联而成。每个基本单元再与其他单元串联成整个EOP芯片,芯片泵可产生的液流压力直接正比于芯片内含的EOP基本单元数量。

液滴技术作为一种新型的微流体控制技术也被应用到了芯片色谱上。Gerhardt等将液滴微流控技术与HPLC芯片无缝组合(见图3b),在HPLC芯片色谱柱出口处耦合T型液滴生成通道。利用与色谱通道正交的油相切割水相色谱洗脱物,将洗脱物以45 Hz的频率切割为大量体积约1 nL的液滴。静态液滴内流体为层流状态,具有低扩散、无返混的特点。因此将色谱洗脱物切割为液滴的过程,相当于将色谱分离的色谱图谱切割成大量片段并进行保存,防止洗脱物返混合污染,最大限度地保留了分离分辨率。这一利用液滴保存色谱结果的技术也为洗脱物在柱后进一步的处理与分析提供了时间和空间条件。

1.4 检测器

相较于常规色谱,芯片色谱需要更加灵敏、响应更快的检测器。芯片色谱常用的检测器可分为光学检测器、电化学检测器、质谱检测器3类。紫外-可见光谱法是分析化学中应用最为广泛的光学检测手段,其简单的结构使其在芯片色谱中有着广泛的应用。但芯片通道尺寸相较常规色谱柱径的大幅度缩小,使得芯片色谱通道的光程大幅缩小。这极大影响了紫外-可见光谱在芯片色谱上原位检测的灵敏度(尤其是当通道宽度小于100 μm时)。因此,在芯片色谱上进行紫外-可见光谱检测需要通过增大通道宽度或添加微结构(如光纤、波导管)等手段来增加光程,以提高检测灵敏度。相比之下,荧光光谱的发射光强度与激发光强度成正相关,在使用激光这样的强光源作为激发光源时(激光诱导荧光光谱,LIF),光程的减小对荧光光谱检测灵敏度的影响几乎可以忽略。荧光光谱主要局限于可自发荧光的物种有限,目前需要借助荧光标记和荧光染料才能做到广泛应用。TPE荧光光谱利用两个光子同时激发一个分子,可使分子达到更高的能级,从而让一些原本不会发出荧光的分子产生荧光信号,该技术有望实现无标记的广泛荧光检测。Hackl等将电色谱芯片与TPE荧光光谱联用(见图4a),实现了芯片色谱平台上的无标记时间分辨荧光光谱检测。该芯片对多环芳烃的检测灵敏度达到了nmol级。他们同时还证明了532 nm的TPE荧光光谱可以达到与266 nm单光子激发(one-photon excitation, OPE)荧光光谱相近的灵敏度。这意味着双光子激发荧光光谱可在聚合物芯片等具有一定紫外吸收能力、但更容易制作的芯片平台上使用,而无标记单光子激发荧光光谱则需要使用石英等低紫外吸收的芯片材料来保证检测灵敏度。除了紫外-可见光谱、荧光光谱外,拉曼光谱、表面增强拉曼光谱也被尝试应用于芯片色谱检测器,并表现出可期的前景。

电化学检测器是通过检测电极表面电化学反应产生的电信号(电流、电压)来进行分析检测的手段。用于电化学检测的电极可以很容易地进行微型化,并集成到微流控芯片平台上。而且,电化学检测的工作站已经可以做到小型化便携式,因此电化学检测方法也被视为实现便携式芯片色谱的重要手段。电化学检测方法在芯片色谱中的应用有一个限制因素:电极的使用寿命有限,需要经常更换;常见的微流控芯片在封装后就无法再拆开,因此电极损坏后检测芯片就只能报废处理。Erkal等为解决这一问题,开发了一种3D打印的电化学检测芯片。这种芯片在电极位置加工了螺纹结构用于可替换电极的固定;同时螺纹结构还满足了芯片的密封需求,使得芯片多次更换电极也不会漏液。相比于常规电导、电势检测需要的电极与溶液直接接触,电容耦合非接触电导检测(capacitively coupled contactless conductivity detection, C4D)不需要与待测溶液直接接触,且电导检测灵敏度极高,其作为微流控芯片检测器更具潜力。Beutner等设计了一种C4D与质谱联用的检测方法,用于毛细管电泳分析检测酚类物质。他们发现这两种检测方法具有较好的互补性:C4D检测器对间甲酚具有极佳的灵敏度而对硝基酚敏感性不佳,而质谱检测器则正好相反。

图 4   部分芯片色谱检测器

质谱法是基于不同质荷比的离子在电场加速后进入磁场中运动轨迹的不同,或在真空中飞行时间的不同,进行物质鉴定的检测方法。质谱法的质量分辨本领使其具有极高的灵敏度和分辨率,以及超快的分析速度,同时还能提供丰富的分析信息。相比于光学检测器和电化学检测器,质谱检测器显然是三者之中结构最为复杂,成本最为昂贵的检测器。但由于质谱法极高的灵敏度、微型化色谱与质谱极好的相容性以及质谱在组学研究中的重要地位,芯片色谱与质谱的联用仍然是前沿的研究方向。芯片色谱与质谱联用需要解决色谱出口与质谱离子源之间的耦合问题。目前常用的芯片色谱-质谱联用离子源是ESI和基质辅助激光解吸电离离子源。ESI离子源因其广泛的应用性和高灵敏度而成为与芯片色谱耦合最理想的离子源。Lotter等对玻璃芯片的ESI喷口进行了较为系统的探究。他们研究了4类ESI喷口形状对质谱检测效果的影响(见图4b),发现在高流速(约400 nL/min)条件下4种芯片喷口没有明显的区别。但是在低流速(<50 nL/min)条件下,尖锐的ESI喷口(pulled和ground型)产生的电喷雾更加稳定,离子化效果更好。加工芯片ESI喷口需要较为精密的加工技术,一种更为简单的喷口构建方法是在芯片柱上嵌入一段拉尖毛细管作为ESI喷口。Dietze等在制作聚合物芯片时,在通道中嵌入一段一端烧蚀拉尖的毛细管,成功与ESI源耦合。这种利用毛细管针尖制作喷口的方法特别适合于聚合物这类无法直接作为ESI喷嘴的芯片基底材料。MALDI离子源应用于微流控芯片上,可分为在线离子源和离线离子源两类。人们已报道了数类微流控MALDI芯片,但带有色谱分离功能的芯片色谱-MALDI-MS较少。Lazar等开发了一种新型的液相色谱-MALDI-MS芯片(见图4c),该芯片以C18颗粒填料作为色谱固定相,在色谱柱通道的正交方向制作了大量与色谱柱通道相通的MALDI收集通道。在进样并完成色谱分离后,洗脱物不再由色谱柱轴向洗脱,而是通过与MALDI收集通道相连的电渗泵结构横向泵入MALDI储液槽中,直接进行MALDI-MS检测。由于MALDI收集通道被集成在色谱柱通道侧向,进行洗脱物收集时相当于对色谱图进行了切割和分段检测,这使得该系统可以获得优良的分辨率和检测通量。

3 总结与展望

从历史上第一个芯片色谱装置诞生至今已近30年,但芯片色谱技术仍基本停留在基础研究和科研实验室里。相较于最初的期待,芯片色谱走向产业化的推进速度显得些许缓慢。目前存在的主要瓶颈在于:芯片色谱技术对微型化、集成化的需求与芯片材料、工艺和设计发展现状的矛盾。微流控芯片微型化、集成化主要通过缩小通道尺寸和增加通道总长度实现。对微纳尺度流体,通道尺寸的缩小和长度的增加都会大幅增加流体阻力。现有的芯片基底材料承压能力普遍在60 MPa以下,材料性质限制了色谱芯片微型化和集成化的进一步提升。这一瓶颈的解决在于发展新型的芯片基底材料,尤其是高强度和优良加工性的聚合物材料;同时也需要产业界形成相对统一标准的流体通道基本结构设计,以提高材料性能的利用度。此外,与芯片色谱匹配的外部设备微型化程度低,芯片接口技术尚不成熟,以及芯片色谱产业缺乏统一行业标准等,都有待学术界与产业界共同努力解决。但客观地看,色谱微型化的趋势已经十分明显:毛细管色谱的产业化、微流甚至纳流色谱的推广及其在生物医学分析中应用已日渐增多。作为色谱微型化另一途径的芯片色谱,正式走向实际应用只是时间问题。芯片液相色谱极高的可扩展性、可集成性以及模块化的优势使其最有可能成为色谱这项技术走入便携检测(POCT)领域的方式,但这一理想还有待进一步提高芯片集成度和系统微型化程度才能真正实现。相信在不久的将来,“plug-and-play”的芯片色谱将成为现实。

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