微流控芯片技术在血细胞变形和流动性分析研究中的应用进展上

摘要：近年来，随着微流控芯片技术的快速发展，微流控芯片在生物医学研究领域得到了广泛关注。由于其具有高通量、高灵敏度、集成化、低消耗及可控化等诸多特点，为在多细胞水平研究细胞迁移和分选动力学提供了新的技术平台。利用微流控芯片微通道结构设计灵活的特点，可在实验条件下模拟正常的生理和病理条件下的复杂血管；其微米尺寸的微通道也适于单细胞引入、操纵及检测。因此，用微流控芯片技术在单细胞层面对细胞生物力学性能表征也引起了广泛关注。以健康和疾病中的血细胞为例，从单细胞变形、流动、黏附、机械疲劳等力学性能表征到多细胞迁移及分离动力学等方面归纳目前微流控芯片技术在细胞力学分析和表征方面的研究进展。

微流控芯片(Microfluidics)又称芯片实验室(Lab-on-a-chip), 是把生物、化学及医学等领域涉及的样品制备、反应、分离、检测等多种技术单元灵活组合、规模集成并完成操控分析的一种微技术平台。由于微流控芯片具有小型化、微量化、定量化及集成化等诸多优势, 因此已被广泛应用于生物医学和环境科学等研究领域。特别地, 由于微流控芯片具有设计灵活的特点, 通过多通道阵列组合可提供复杂的微通道网络结构(如直线型、弯曲蛇形、多边形、折叠形), 可用于模拟生理和病理环境复杂的微血管环境。因此, 利用微流控芯片技术研究健康与疾病中血细胞在微血管内的流动和变形性能引起了研究人员的广泛关注。

血细胞又称"血球", 是存在于血液中的细胞, 能随血液的流动遍及全身。血细胞通常分为3类:红细胞、白细胞和血小板。红细胞呈双凹圆盘状, 直径约为7~8 μm, 有一定的弹性和可塑性, 主要功能是运送氧; 白细胞体积比红细胞大, 能作变形运动, 具有机体防御和免疫调节功能; 血小板呈圆盘形, 当受到机械或化学刺激时, 则伸出突起, 呈不规则形, 其主要功能是凝血和止血以及修补破损的血管。机体的生理和病理变化往往会引起血细胞数量或质量(功能)的改变, 进而引起贫血、发热、感染、出血和血管栓塞等临床症状。例如, 在微血管系统中, 红细胞在组织的氧合作用中发挥着重要作用。当红细胞流过狭窄毛细血管时, 由于存在剪切应力, 红细胞会在毛细血管中发生压缩变形, 进而促进红细胞与周边组织的氧气交换。而在病理状态下, 红细胞变形性能的下降阻碍了细胞通过微血管的转运。

血液是一种具有相当黏性的流体, 其在血管内的流动行为有着明显的黏性流动特性:在靠近血管壁处血液流动满足斯托克斯流特征, 而在远离血管壁的区域则又呈现明显的泊肃叶流特征(图 1(a))。因此, 血液在血管内流动时, 红细胞在惯性升力和细胞-血管壁相互作用下会发生变形并迁移至血管中间区域。我们知道, 红细胞几乎占据了40%~45%的血液体积, 因此, 血管中红细胞的迁移及运动行为主导了血流动力学并致使白细胞和血小板向血管壁附近区域迁移(图 1(b))。利用血流这一特殊的动力学特征, 人们发展了多种微流控芯片装置, 用于分离和采集特定类型的血细胞, 并在临床诊断和个性化治疗等方面发挥了重要的作用(图 1(c))。本文将结合国内外最新研究进展, 以健康和疾病中的血细胞为例, 从单细胞变形、流动、黏附等性能表征及多细胞分离和迁移动力学等方面简单归纳目前微流控芯片技术在血细胞力学分析和表征方面的应用进展。

图 1 血细胞在血管内流动的动力学特征及微流控仿生模型设计

1 微流控芯片在血细胞变形和流动性能研究中的应用

1.1 血细胞在毛细微管道内的流动和变形

需氧代谢是人体维持生命活动的基本条件, 血液的运输功能主要依靠红细胞来完成。在血液循环过程中(特别是在微循环过程中), 红细胞必须具有良好的变形性能才能顺利地通过口径比它小的毛细血管网和血窦孔隙。然而, 在病理条件下, 红细胞变形性能降低, 高切黏度增高, 从而增加了血液的外周阻力, 影响到血液循环以及组织和器官的血液供应。因此, 研究红细胞的变形性能, 对理解基本的血液循环及血液疾病的临床表现均具有重要意义。基于此, 人们发展了单通道和多通道等不同类型的微流控芯片装置, 用于探索红细胞在毛细管内的流动行为和变形性能。单通道微流控芯片指在一个芯片上仅含有一个微通道, 结构相对简单, 可准确检测单个血细胞在毛细管道内的流动及变形性能; 多通道微流控芯片也称为集成微通道芯片, 其在一块芯片上包含有多个微通道, 这样便可以在同一芯片上同时并行处理多个样品, 具有高通量和高灵敏度的特点, 从而提高了微流控芯片通量及检测效率。此外, 多通道微流控芯片的多维网格结构可模拟复杂的血管分支网络和血流微循环环境, 可用来研究微血管堵塞及血栓形成过程。由于多通道芯片结构复杂、控制参量多, 因此对实验操作及控制条件(如压力梯度、来流速度等)提出了更严格的要求。本文重点综述这方面的一些研究工作。

1.1.1 单通道微流控芯片

单通道微流控芯片可在高灵敏度下研究红细胞在毛细血管内的流动, 并直接观察到细胞、亚细胞水平的动态和不连续过程, 从而帮助人们更好地认识几种红细胞疾病。例如, 李巨及其合作者设计了一种单通道微流控芯片来研究红细胞随毛细血流的流动特征(图 2)。他们发现当红细胞挤入狭窄的毛细管道时(微通道尺寸只有4 μm), 细胞会发生很大的变形(图 2(c)), 但一旦穿过后则很快恢复其最初的圆盘状结构(图 2(d))。同时, 他们基于亚细胞层面的红细胞模型结果分析, 认为细胞骨架重组可能是这种大变形的原因。Quinn等利用类似的微流控芯片装置, 对红细胞在毛细血管内的流动规律进行了定量探索。通过调节通道出入口压力梯度控制流体流速, 他们分析了不同压降下红细胞通过毛细管的流动速度, 发现细胞流动速度随压力梯度近乎呈线性变化。由此可见, 基于单细胞微流控芯片的实验和亚细胞层面的模型分析可以帮助人们理解红细胞在毛细血管内的流动规律。

图 2 基于单通道微流控装置研究健康红细胞在毛细管内的流动和变形。(a)~(d)显示红细胞在流过毛细管不同区域时的变形

人们也通过电学测量的手段研究毛细管内流动红细胞的变形性能。我们知道, 流过毛细管的红细胞经历了瞬时形状演变, 而其特征形状的恢复时间, 可以作为红细胞变形性能的标志之一。在恒定剪切力下, 红细胞流过与其自身尺寸相近的毛细管时, 会发生挤压变形。通过实验发现, 红细胞变形的严重程度与沿微流体通道施加的电流的信号强度成比例。基于此, 人们可以通过红细胞的特征伸长指数推断其变形性能。

红细胞血液病是血液系统发病率较高的疾病。近年来的研究表明红细胞的膜结构及变形性能与很多血液疾病的发生和发展都密切相关。目前, 人们通过微流控芯片可测定病变红细胞的变形性能, 从而获得有关血液疾病临床状态以及药物疗效的一些关键信息。例如, Shelby等设计了一种单通道微流控芯片来测定恶性疟原虫感染的红细胞(后文简称"疟疾感染红细胞")的变形性能变化。他们从患者血液中获取不同感染程度的红细胞, 并将其放在黏性流体中稀释, 然后使其通过不同尺寸的狭窄矩形毛细微管道(图 3)。这些感染的红细胞有不同的形状和刚柔性, 进而影响其在微通道内的流动行为。他们发现感染初期的环状体(Ring)红细胞可正常通过毛细微管道(图 3(a1)~(b4)), 而处于滋养体(Trophozoite)阶段的红细胞可通过较宽尺寸(6和8 μm)的微管道, 但无法顺利通过更狭窄(2和4 μm)的微管道。但是, 处在裂殖体(Schizont)阶段的红细胞变形性能明显减弱, 仅能通过8 μm的毛细管(图 3(b1)), 而无法通过6 μm及以下的毛细管(图 3(b2)~(b4))。

图 3 基于单通道微流控装置研究疟疾感染红细胞在不同尺寸的毛细管内的流动及堵塞行为。自左至右毛细管的宽度分别为8、6、4及2 μm。感染初期的环状体红细胞可顺利通过毛细管道((a1)~(a4)); 感染末期处于裂殖体阶段的红细胞仅能通过8 μm的毛细管道(b1), 但无法通过6 μm及以下的毛细管并导致微通道的堵塞((b2)~(b4))

Guo等设计了一种轻便的微流控芯片装置来研究疟疾感染红细胞变形性能的变化。这种微流控装置借助一系列紧压的"漏斗形收缩"使得红细胞变形通过(图 4(a)~(b)), 然后根据测定的推动细胞流过"漏斗形收缩"的压力大小分析感染红细胞的变形性能。结果表明, 在恶性疟原虫感染红细胞的各个阶段实时精确测定感染红细胞的变形性能是可能的(图 4(c))。

图 4 基于单通道"漏斗形收缩"微流控装置研究疟疾感染红细胞的流动及变形行为。(a)感染初期的环状体红细胞在较小的压力梯度下可通过漏斗形收缩微管道; (b)感染末期处于裂殖体阶段的红细胞则需要较大的压力梯度才能通过微细管; (c)基于实验结果统计得到的不同感染阶段的红细胞膜皮质张力

1.1.2 多通道微流控芯片

利用微流控芯片装置进行血细胞性能分析时, 由于单个血细胞的尺寸很小, 因此往往只能对微量的血液样本进行检测。在多数情况下, 感染或者病变血细胞在微量血液样本中含量极少。因此, 如何从微量血样中对含量极少的感染红细胞进行分析检测是一个亟待解决的问题。为此, 人们设计了多通道微流控芯片, 可在高通量和高灵敏度下对血细胞进行直接的力学分析和变形性能测量。同时, 微流控芯片的多维网络结构可连通成网, 可以模拟复杂的几何形态和更逼真的血流微循环环境。目前, 多通道微流控芯片已被用于研究健康与疾病中血细胞的变形、聚集及微血栓形成等方面。根据本课题组及合作者在此领域的实验积累, 介绍以下3个方面的研究进展。

(1) 基于多通道微流控装置研究疟疾感染红细胞在毛细管内的流动行为。Bow等设计了一种多通道微流控装置, 可从仅含有极少量疟疾感染红细胞的血样中对感染红细胞进行直接的变形性能检测。他们设计的微流控装置上有多组并排的、宽度仅为3 μm的微管道阵列(图 5(a))。当红细胞在微流道内流动时, 必须通过变形以流过微管道阵列(图 5(b), 箭头所示)。相比健康红细胞而言, 疟疾感染红细胞更难挤入狭窄微通道, 且在微流道内流动速度更慢, 说明受感染的红细胞变形性能有明显的降低。同时, 他们发现微管道入口的形状(收缩式入口及发散式入口)也会对红细胞的流动行为有明显的影响。相比于发散式入口微管道结果, 受感染的红细胞更容易进入收缩式入口微管道, 且其在微流道内的流速也有明显的增加。因此, 借助该微流控芯片装置可以更好地分析受感染的红细胞的流动行为, 并帮助医学工作者更好地诊断疾病。

图 5 基于多通道微流控装置研究受疟疾感染红细胞在毛细管内的流动行为。(a)微流道装置示意图。微流道内有多组并排的宽度仅为3 μm的微管道阵列, 红细胞流过微管道阵列时需变形才能通过; (b)通过实验获得的健康红细胞(蓝色箭头所示)和疟疾感染红细胞(红色箭头所示)在多通道毛细管内的流动现象

(2) 基于多通道微流控装置研究镰状细胞贫血症下红细胞的镰变过程及其对细胞变形和流动的影响。镰状细胞贫血症是一种常见的遗传性血液疾病, 也是人类发现的第一个分子疾病。其临床表现为慢性溶血性贫血、易感染和再发性疼痛危象以致局部缺血从而导致器官组织损害。为了探索红细胞的镰变过程及其导致的毛细血管堵塞现象, 研究人员需要对红细胞所处微环境的氧气浓度进行调控并模拟镰变红细胞在毛细血管内的流动和堵塞情况。然而, 从实验角度来看, 利用常规实验仪器实现这样的细胞微环境有较高难度。Du等利用互联多通道微流控装置克服了这一局限。该装置允许研究人员调控氧气水平和脱氧程度, 进而控制红细胞的镰变过程并分析红细胞从发生镰变到诱发镰状细胞危象的整个过程(图 6(a)和(c))。他们发现, 当氧气浓度非常低或处于缺氧状态时, 红细胞发生镰变, 不但在外形上由圆盘状变成镰刀状(图 6(b)), 其变形性能也有明显异常:镰状红细胞变形性能差, 进而在微管道阵列中发生堵塞(图 6(d))。同时, 他们发现红细胞镰变的初期是可逆的, 给予氧可逆转细胞镰变过程。所以, 一旦把镰变红细胞置于有氧环境时, 红细胞可迅速恢复圆盘状结构且可通过变形流过微管道。

图 6 基于多通道微流控装置研究镰状细胞贫血症下红细胞的流动和变形性能。(a)通过调控氧气水平和脱氧程度控制红细胞的镰变和可逆转镰变过程; (b)当处于缺氧状态时, 红细胞发生镰变后导致其形状发生变化(黄色箭头所示); (c)微流道装置示意图。微流道内有多组并排的宽度仅为4 μm的微通道阵列, 红细胞需变形才能通过; (d)在有氧(上图)和脱氧条件(下图)下, 观察红细胞在毛细管道内的流动及堵塞现象

此外, 镰变红细胞还可使血液黏滞性增加, 血流缓慢, 加之变形性能差, 易堵塞毛细血管和小静脉血管, 从而引起局部缺氧和炎症反应导致相应部位产生疼痛危象。为了探索镰变红细胞如何与血管相互作用引发血管栓塞, Papageorgiou等人利用互联多通道微流控芯片装置研究了镰状红细胞黏附毛细管道壁的动力学过程。实验结果表明, 镰变初期的红细胞在毛细管中可显著地黏附于管道壁, 缺氧会进一步增强这些红细胞的黏附, 但是对镰变末期的红细胞无明显影响; 同时, 他们发现镰状网织红细胞表现出独特的黏附动力学行为:镰状网织红细胞可以从细胞表面向外生长的镰状纤维处产生新的黏附位点, 进而促进细胞黏附。该互联多通道微流体模型的实验结果证实了镰变初期的红细胞在微环境中导致血管栓塞形成的重要作用。该芯片的设计接近体内微血管通道, 可作为一种易于使用的体外模型, 用来探索毛细微通道中病变红细胞的黏附及流动行为。

(3) 血液疾病微血管阻塞及血栓模型。微血栓是微循环的血管中由于血细胞或纤维蛋白互相粘结而成的一种均质无结构的微小血栓。由于微血栓尺寸小, 所以在一般的病理检查(包括X光、B超、心电图等)时难以发现, 其在体内的形成过程更难以检测。近年来, 人们借助微流控芯片技术尝试研究微血管阻塞及微血栓形成过程。例如, Tsai等设计了一种微流控器件来模拟变狭窄的小动脉血管, 可以在生理和病理血流下分析微血管堵塞及血栓形成的过程。该微流控器件内含有多组互通且分叉的微管道(最小尺寸为30 μm), 以模拟毛细血管后小静脉和动脉形成的复杂血管网络(图 7)。利用该微流控芯片可模拟包括血液-内皮细胞黏附、多细胞聚集等力学因素导致的血流动力学环境的变化, 以及模拟包含肿瘤坏死因子a (TNF-a)、突触融合蛋白2 (STX2)等在内的多种生化因素促使微血管血栓形成的过程。借助该微流控芯片, 他们还定量研究了羟基脲(Hydroxyurea)药物对镰状细胞贫血症引发的微血管堵塞的影响, 发现该药物可降低微血管栓塞的几率, 从而为解释该药在临床上的药效作用提供了细胞水平的依据。该研究表明, 基于微流控芯片的微血管堵塞及血栓模型是连接体外实验和体内实验的一座桥梁, 为血液疾病微血管栓塞的病理研究及相关药物筛选提供了条件。

图 7 基于多通道微流控装置模拟微血管堵塞及血栓形成过程。(a)微流控芯片装置图; (b)微流控芯片中多通路微管道网络示意图, 其中最中间一排的微管道宽度只有30 μm; (c)微流控芯片上"内皮细胞化"微血管分叉结构; (d)血细胞-内皮细胞黏附及多细胞聚集导致的微血管堵塞现象。

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