微流控芯片技术在血细胞变形和流动性分析研究中的应用进展下

1.2 血细胞分离和采集

血细胞分离和采集是从全血中把某种特定类型的血细胞(如红细胞、白细胞和血小板等)分离、纯化并进行采集, 在生物学和医学研究以及血液疾病临床诊断和治疗中具有非常重要的作用。通过微流控芯片装置可以对少量血样快速、高效地检测并分离出不同种类的血细胞。目前, 以微流控芯片为研究平台的血细胞分离采集方法主要有2种:(1)以细胞微结构和物理/力学特性为基础的细胞被动分离; (2)通过在微流控通道中施加外加力场驱动细胞分离。

1.2.1 以血细胞微结构和物理/力学特性为基础的细胞分离

流体流动时, 在黏弹性效应和惯性效应作用下, 大颗粒将向靠近侧壁的横向位置迁移。类似地, 当血液在血管中流动时, 尺寸较小的柔性红细胞将迁移至血管中间区域, 而尺寸较大的刚性白细胞及肿瘤细胞将向血管壁周围迁移。利用这一特殊的血流动力学特征, 一些课题组设计了微流控芯片用于分离并采集不同类型的血细胞。例如, Liu等基于细胞物理特性和流体黏弹性效应设计了一种微流控芯片, 不同大小的细胞在微流道内流动至不同的通道:红细胞汇聚在中间通道, 而肿瘤细胞在两侧通道内富集[28], 成功实现了循环肿瘤细胞和红细胞的完全分离。此外, 他们通过改变作用于囊泡的流体力, 成功实现了外泌体从胞外囊泡的分离采集。类似地, Zhang等利用该方法实现了红细胞与血浆的加速分离。Hou等设计了一种可以控制液体流动的微流控芯片, 通过不同的管道设计与流速调节改变微流道内的流体力学特征, 进而利用血细胞在大小、形状及刚柔力学特性的不同, 从微量血液样品中分离出了特定的血细胞, 包括疟疾感染的红细胞、循环肿瘤细胞及不同种类的白细胞, 最终达到了检测的目的。

图 8 基于惯性效应和黏弹性效应设计的微流控装置用于特定类型血细胞的分离采集。(a)微流道内疟疾感染红细胞和健康红细胞的分离; (b)微流道内循环肿瘤细胞、白细胞和红细胞的分离

1.2.2 通过在微流控通道中施加外加力场驱动的细胞分离

通过在微流控通道中施加外加力场驱动细胞分离的方式主要包括介电电泳力驱动、磁场作用力驱动、超声波驱动等3种。

(1) 介电电泳力驱动。介电电泳技术描述的是位于非均匀电场的中性微粒由于介电极化的作用而产生的平移运动。当处于非均匀电场中时, 血细胞产生极化现象, 其表面会产生偶极矩, 进而在介电电泳力的作用下, 向更强的电场强度方向移动(阳性介电电泳)或者更弱的电场强度方向移动(阴性介电电泳)。由于血细胞所受介电电泳力的大小取决于血细胞的大小和形状、以及悬浮媒介的介电性质和黏度特性等因素, 因此在微流控芯片上进行介电电泳可实现血细胞的分离。介电电泳细胞分离技术具有无需标记、无需表面修饰和特异性高的特点, 因此, 以微流控芯片介电电泳为基础的分离采集技术在血细胞分离领域已被广泛应用。例如, Nascimento等利用微流控介电电泳实现了受寄生虫感染的红细胞与健康红细胞的分离采集。当红细胞受到寄生虫感染后, 其细胞膜微结构和表面抗原会发生一定程度的变化, 同时, 细胞膜通透性也会有一定程度的增强, 导致感染红细胞和健康红细胞在介电场中所受介电电泳力的方向和大小都有不同, 进而迁移至不同的微通道, 实现分离采集的目的。

(2) 磁场作用力驱动。对目标血细胞用微型磁珠进行磁性标记, 被磁性标记的血细胞流经磁场区域时, 磁场作用力使目标血细胞偏离原来的运动轨道。不同大小和磁化率的血细胞流经梯度磁场时所受磁场作用力不同从而实现分离采集。例如, Karabacak等利用惯性效应及磁场效应设计了一种微流控芯片装置, 成功实现了对纯循环肿瘤细胞的分离富集。这套微流控装置前半部分的微通道内布满了倾斜的微柱阵列, 尺寸小的红细胞/血小板和尺寸大的白细胞/癌细胞在微柱阵列中受到惯性升力不同而分离至不同的微通道(图 9(a))。接下来, 白细胞和癌细胞的悬浮液经过中间微通道流经磁场区域, 在磁场作用力和流体驱动力的共同驱动下流向不同的收集通道, 从而将低浓度的癌细胞从白细胞中分离出来(图 9(a))。Zhao等利用磁流体对不同类型细胞的作用力不同设计了2种微流控装置(图 9(b)), 实现了循环肿瘤细胞和白细胞/红细胞的分离。另外, 利用磁流体方法可测量红细胞在磁性介质中的悬浮情况, 进而评估红细胞的变形性能。例如, Tasoglu等将红细胞浸入溶液里, 然后注入夹在2个磁体中间的毛细管中。磁力从毛细管底部到顶部垂直减小, 因此红细胞的最终平衡位置由细胞的密度确定。这种方法可以区分并分离健康和被感染的红细胞。

图 9 微流控通道中细胞分离示意图。(a)~(b)基于惯性升力和磁场效应从微量血液样品中实现肿瘤细胞和血细胞的分离采集; (c)~(d)通过超声波微流控装置从血细胞混合液中分离肿瘤细胞

(3) 超声波驱动。对通过微通道的流体施加一定角度的声波, 其产生的压力可推动悬浮在液体中的颗粒移动。与正常的血细胞相比, 声波对癌细胞的推力更大, 故可将肿瘤细胞推到单独的微通道。例如, Ding等人设计了一个外加表面声波的微流控装置实现了循环肿瘤细胞的分离捕获。这套微流控装置的两端装有2个产生声波的传感器(图 9(c))。当两股声波相遇时, 产生的压力能推动细胞移动。他们利用此方法从乳腺癌患者的血液中成功检测到极为罕见的肿瘤细胞。Collins等使用高频聚焦表面声波垂直作用于流体, 进而推动流体流动并在微通道中产生流体涡流。他们利用流体涡流形成的涡旋实现了多种不同尺寸颗粒的分离捕获, 并从红细胞和癌细胞混合液中成功捕获了乳腺癌细胞(图 9(d))。基于微流控超声波驱动的细胞分选具有无需配体、无需标记和生物兼容的特点, 同时, 由于每个细胞仅在不到1 s的时间内经历声波, 因此, 与其他细胞分离捕获技术相比, 该技术显得更为温和, 对分离血细胞损伤的风险大大降低。

1.3 血细胞机械疲劳损伤

软物质材料会在长期的循环应变作用下发生损伤和断裂, 也就是机械疲劳。类似的, 在生物细胞中, 例如红细胞, 在循环应力的作用下也会产生机械疲劳。Du及其合作者基于介电电泳技术设计了一种包含振幅调制电极的微流控芯片, 研究了循环机械应变下单个红细胞的机械疲劳损伤行为。实验结果表明, 在一定的循环载荷下, 红细胞会产生机械疲劳效应; 同时, 在相同的累积加载时间和相同的最大载荷下, 动态循环载荷比静态载荷对红细胞膜的损伤更大。此外, 他们发现不同的载荷形态(如方波载荷、拟正弦波载荷等)对红细胞膜损伤的影响程度也有所不同:与拟正弦波载荷实验结果相比, 循环方波载荷对红细胞膜机械变形影响更为显著。他们还发现机械疲劳效应会导致磁滞和能量耗散, 持续的机械疲劳对血细胞的结构完整性和生物学功能有着不利影响。这样的疲劳测试平台可用来定量表征血液循环过程中单个血细胞累积的细胞膜损伤, 帮助人们了解血细胞的应力波动对其生物力学特性的影响。

2 总结及展望

红细胞变形性能对血流性质有重大影响, 它是决定高切率下血液黏率的关键因素。许多血液病变是由于红细胞变形性能低下导致的。例如, 疟疾感染红细胞和贫血症下镰状红细胞的变形性能会减弱, 不利于红细胞通过狭窄毛细血管; 遗传性球形红细胞增多症下球形红细胞由于体表比增加进而使红细胞很难变形。目前, 人们已发展一些实验技术来研究病变红细胞的变形性能及生物力学响应, 然而, 在单细胞水平研究红细胞的变形和流动特征仍面临很大挑战。近些年来迅速发展的微流控芯片技术凭借其特有的优势为健康与疾病中的红细胞力学性能研究提供了一个很好的平台。随着微流控芯片技术的不断发展, 如何模拟更复杂的几何形态和更逼真的血流微环境, 把血细胞形状的动态变化和各种疾病的病理变化及临床表现联系起来, 将是未来工作的一个重点和难点。

同时, 基于微流控芯片技术的器官芯片(Organ-on-a-chip)近几年来发展迅速, 已经实现了体外模拟多种活体细胞、组织及器官微环境。为适应人类器官及血管的复杂性, 未来的研究需要建立更加复杂的多器官微流控芯片(Multi-organ-on-a-chip)系统, 将不同器官芯片模型应用到类似人体的血液循环环境中。目前热门的3D生物打印技术具有精确的控制能力和个性化特点, 使得"定制"人体组织器官成为可能。通过在芯片上打印特定带血管的器官, 可以更好地模拟细胞、血管及组织微环境并建立患者特异化(Patient-Specific)的血管及器官模型, 进而从细胞-组织-器官等不同层面多尺度探索相关疾病的发生机制, 并进行更加系统的药物毒性检测和药效评估。

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