基于微流控技术实现严格厌氧条件下的细菌单细胞培养与实时观测（上）

当下微生物研究存在两个趋势，一是随着大量肠道微生物相关研究的开展，研究者们越来越认识到肠道微生物尤其是大量厌氧菌与人类健康息息相关，因为肠道本身在某种程度上也属于厌氧环境，故对肠道细菌的细胞生理学研究需要建立在厌氧培养环境的基础之上；二是仅依靠经典的微生物群体培养方法已经难以满足对细胞异质性的研究，需要发展多种方法在单细胞水平进行细菌生理学研究，以此深入研究被细胞群体所掩盖而被研究者忽略的生理规律。该研究开发了一种微生物在厌氧条件下的培养方法，包括相关培养装置设计与相应的实验方法流程，在稳定维持培养环境严格厌氧程度的基础上，使用微流控芯片对细菌进行长时间的单细胞培养，同时结合高分辨率显微镜延时成像技术，在培养的同时实现对生长动态的实时观测与数据采集。该方法为细菌细胞在厌氧条件下的单细胞分析提供了有力的技术支持。

 近年来，得益于 DNA 测序技术的不断迭代优化，微生物组研究取得了蓬勃发展。微生物培养方法是微生物相关研究的绝对基础，是不可绕开的关键一环。传统的微生物培养方法包括选择培养法、平板单克隆培养法、基于密度/细胞尺寸筛选法和有限稀释法等，均为微生物实验室的常用基础方法。微生物学家通过各种培养方法能够获得特定细胞株系的纯培养，进而为各种细胞生理学实验提供准确而充足的研究对象。但由于某些微生物相关培养方法的缺失，大大阻碍了研究者对其一些基本属性的认知，进而影响到相关生态以及生物学现象的研究。

传统细菌培养方法所得到的纯培养物，理论上应是来源于同一菌株，几乎不存在明显的遗传变异，通过对其进行测量能够获得许多生理学参数，包括生长速率、死亡率、细胞尺寸分布和基因表达强度等，也能够获得类似Monod 方程这样对工业生产有着一定指导意义的经验公式。而随着对细胞生理状态噪声与随机波动相关研究的逐渐深入，研究者们越来越意识到细胞异质性的存在与重要性，即从某种角度来讲每个单细胞都可能与其他细胞有所区别。若要对细菌进行单细胞水平的培养与研究，则传统的群体培养方法已不能满足要求，需要开发新的实验培养技术。

在细菌单细胞水平进行生理学研究的重要技术手段之一是利用基于微流控技术的高分辨显微镜延时拍摄方法。其中，微流控技术可以实现单细胞培养，并且有着高度的可设计性和对实验条件的可控性；而显微镜延时拍摄方法则是在不影响细胞生理活动的前提下，实时采集各种参数，与“下一代细菌生理学技术”的理念高度符合。目前相关技术的报道仍主要集中于常规件的有氧培养，对于与人类健康息息相关的大量厌氧菌与兼性厌氧菌的厌氧生理学的研究则相对较少。该技术的主要难点在于既要确保培养装置的气密性，又要将整个培养系统(包括微流控装置、气体控制装置等)与相关商业化显微镜进行适配。此外，由于厌氧条件下细菌生长相对较慢，需要确保整个系统能够长期稳定的运行。

本研究提供了一种厌氧微生物培养与实时观测装置。该装置包括：底座、上盖、微流控芯片和培养液储存室。其中，培养装置上盖水平面上设有亚克力板或玻璃板视窗，与微流控芯片底部盖玻片相对设置，便于显微成像；培养基储液池上设有出液孔，可与微流控芯片相连为细胞培养提供充足的营养；培养装置上盖的侧壁上设有气体入口、气体出口和出液口，以便维持培养装置内的厌氧氛围、气压稳定以及液体的流通。该装置具有优异的气密性，能够为厌氧微生物提供长时间稳定的厌氧气体氛围且气体氛围可控；同时可以满足高通量、大范围多位点采样，高放大倍数拍摄等实验需求。

2 材料与方法

2.1 实验方法

2.1.1 微流控芯片的设计

 本实验所使用的微流控芯片被称为母细胞芯片(Mother Machine)于将细菌许多单个母细胞(Mother Cell)保持在固定位置持续生长，具体设计如图 1 所示。其中，图 1(a)中单细胞生长通道总数 4 000，宽度为 0.8～2.6 μm (以 0.2 μm 的梯度增加)，高度为 1.2 μm，长度为 25 μm；培养基通道宽度为100 μm，高度为 100 μm，箭头表示其中液体培养基流动。采用聚二甲基硅氧烷(PDMS)制作的芯片整体封接在盖玻片(尺寸 24 mm×50 mm)上，具体内部结构处于 PDMS 与盖玻片之间：细菌细胞单层生长于较窄、较低的众多生长通道内，这些单细胞生长通道一端为封闭端，另一端开口与更宽、更高的培养基通道相接，培养基通道两侧开头通过持续不断的液体培养基流动，以及营养物质的扩散作用，为单细胞生长通道内的细胞提供源源不断的营养成分。在营养充分的条件下，通道内的细菌细胞随着时间推移逐渐沿着生长通道分裂生长为一条线，多余细胞通过分裂生长自然伸出生长通道，被培养基通道内的高速液体流动冲走。此时，处于生长通道封闭段的母细胞在微流控芯片内的相对位置不变，其营养条件也是稳定的，因而整个微流控芯片设计可被看作一种单细胞水平的微量培养恒化器。

                                                                                                                        (a) 示意图                                                                                                                   (b) 实物图

图 1 母细胞芯片微流控芯片图

2.2.2 硅片模板

 (1)单细胞生长通道的制作

 a. 准备 76.2 mm 的硅片，用低强度等离子处理 30 min。

 b. 从冰箱中取出 SU-8 2002 光刻胶和 SU-8 2000.5 光刻胶，待光刻胶温度与室温一致时，按V(SU-8 2002)∶V(SU-8 2000.5)＝8∶2(体积比)将两种胶在离心管中混匀。

 c. 设定匀胶机程序：预甩 600 r/min，9 s；匀胶 4 000 r/min，30 s。

 d. 将表面洁净的硅片置于匀胶机吸盘上，在硅片上添加室温混合胶 2 mL，运行程序。

 e. 将硅片置于平整的热板上 95 ℃ 烘 2 min。

 f. 在曝光机的吸盘周围套入橡胶圈，将第一层铬板掩膜清洁干净后放在台架上(镀铬面向下)，并开启真空，将一块较大的锡箔纸盖在掩膜上。

 g. 将硅片放在吸盘上，待冷却后推入(记录此时硅片的位置，确保在后续可以对准结构)。

 h. 上升吸盘，用锡箔纸遮盖，执行真空曝光，观察真空表读数——如果漏气，则复位吸盘后再次上升，确保橡胶圈与掩膜贴合良好不漏气。

 i. 曝光量为 70 mJ/cm2，需要根据曝光机的功率调整曝光时间。其中，预设曝光时间应长于真实曝光时间(如需曝光 4 s，则设置 30 s 曝光时间)。启动曝光时先用锡箔纸遮挡，当剩余时间等于需曝光时间时，快速撤下锡箔纸，结束曝光。

 j. 曝光后于 95 ℃ 烘 1 min，取下硅片，冷却。

 k. 用丙二醇甲醚醋酸酯(PM)显影液显影；随后用异丙醇冲洗残留显影液，接着用氮气吹干表面，于体视显微镜下观察显影效果。

 l. 若显影后结构清晰，则用烘箱 180 ℃ 坚膜1 h，否则重复上一步。

 m. 冷却后取出，用台阶仪测量子通道高度并记录。

(2)培养基通道的制作

 整体实验流程与上部分单细胞生长通道的制作相同，但需要修改一些具体的实验参数：使用SU-8 3025 光刻胶，离心 3 000 r/min，前烘30 min，需要进行校准使其与第一层对齐，曝光量为 150 mJ/cm2，后烘 5 min。

2.2.3 PDMS 芯片制作

 (1)固定硅片模板

 a. 将硅片模板用透明胶贴在玻璃板中间(勿贴到结构)，同时在玻璃板四周竖着贴上锡箔胶带密封，防止倒入 PDMS 单体后在热固化时泄漏；

 b. 将 PDMS 单体和引发剂以 10∶1 的质量比混合，搅拌(5 min)均匀，然后抽真空 15 min，再用洗耳球吹除表面剩余气泡；

 c. 将上一步无气泡 PDMS 与引发剂的混合液体，适量倒入第(a)步制作好的贴有硅片模板的玻璃板容器内，放入烘箱内的水平台上，80 ℃、烘 30 min 以上。

也可以直接用无尘胶带将模板贴到玻璃板容器中间后，直接倒入 PDMS 和引发剂进行 PDMS 芯片固化。

 (2)PDMS 芯片固化

 a. 将 PDMS 单体和引发剂以 10∶1 的质量比混合，搅拌(5 min)均匀后抽真空(10 min)，最后用洗耳球吹除表面剩余气泡；

 b. 根据硅片模板表面积及所需微流控芯片厚度计算 PDMS 和引发剂混合液体用量(这里芯片厚度约为 5 mm，PDMS 和引发剂混合液体需22 g 左右)，倒在硅片模板上，整体放入烘箱，80 ℃ 烘 1 h 以上。

(3)PDMS 芯片切割

使用手术刀将固化好的芯片从硅片模板上切下，注意不要太靠近芯片结构，刀落到硅片上，切到底可见空气进入的痕迹，然后将芯片放在LED 灯上进一步切割。

(4)PDMS 芯片打孔

将 PDMS 芯片放在 LED 灯上操作，选择合适孔径(这里为 0.8 μm)的打孔器从结构面向下打，拔出时要小心缓慢，可双向旋转拔出，注意不要裂口，然后用氮气气流清理打好的孔(注意打孔器的针头最好频繁更换，以避免打孔时产生过多的 PDMS 碎屑对单细胞培养时产生堵塞通道，可在正式打孔前测试一下)。

(5)PDMS 芯片与盖玻片封接

 a. 先用异丙醇清洗盖玻片，然后氮气吹除异丙醇液体；

 b. 用无尘胶带粘去 PDMS 芯片结构面灰尘及碎屑；

 c. 将盖玻片和 PDMS 芯片结构面向上放置，一起进行等离子清洗——HI 档(18 W，气压266 Pa，气流 25 mL/h)，2 min(等离子处理时间可调整，一般不要超过 2 min)；

 d. PDMS 芯片依靠重力贴在玻璃板上(多块芯片考虑排布以合理利用空间)，若贴合过程迅速则表明等离子处理后 PDMS 芯片和盖玻片表面性质良好；

 e. 贴合后的芯片放入烘箱 80 ℃ 烘 10 min。

 (6)通道修饰及镜检

 a. 将已过滤除菌的 1% F-127 水溶液，通过培养基通道入口缓慢注入芯片(戴护目镜)，修饰至少 30 min；

 b. 10 倍镜或 20 倍镜下检查芯片通道(是否完好)、打孔及封接情况，无误后放入厌氧工作站。

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