基于微流控技术实现严格厌氧条件下的细菌单细胞培养与实时观测（下）

2.2.4 单细胞实验

 (1)细菌培养与预处理

 在厌氧箱内进行平板划线，挑选 5 个单菌落于 3 mL 液体培养基内进行活化过夜，过夜培养所得的菌液与培养基按 1∶100 转接至 120 mL培养基培养至对数后期。用封膜封住离心管口后，将菌液以 5 000 r/min 离心 10 min。倒出上清液，重悬沉淀再次离心，以 5 000 r/min 离心5 min。使用含 0.01 g/mL F-127 的上清液重悬菌体，涡旋混匀。其中，固体培养基为 LB 琼脂(E. coli)和 BHI 琼脂(B. fragilis)，液体培养基为RDM+glucose (E. coli)和 BHIS (B. fragilis)。

 (2)细菌装载

 将混匀的浓缩菌液注入芯片，采用无尘胶带贴上芯片出入口，将芯片固定在培养皿内，封膜，以 2 000～2 500 r/min 离心 5 min。在厌氧工作站内将芯片固定于自制厌氧培养盒内，密封好后架设到显微镜上，连接气路和液路。

 (3)单细胞延时拍摄

 待厌氧盒内氧气指示剂保持粉色，使用 100×油镜观察荧光场——若无可见荧光激发(E. coli)，则开始选点进行延时拍摄。实验完成后，使用自主研发的相关软件进行图像处理与数据分析。

3 实验结果

3.1 厌氧程度评估

 本实验体系的关键点在于单细胞培养时厌氧条件的维持，这里从培养气体氛围与细胞学水平证据(荧光蛋白激发)来进行评估。

3.1.1 气体氛围

 厌氧培养盒在实验中会持续通入厌氧混合气——95% N2＋5% CO2，以营造并长期维持盒内厌氧环境。其中，N2 为模拟空气主要成分，生理意义不大，一定浓度的 CO2 为细菌正常生长所必需。该气体组成与常用的厌氧工作站基本相同，只是缺少 H2，而 H2 在厌氧工作站的主要作用是便于在催化装置的作用下与 O2 反应生成H2O 以达到除氧的目的，但由于厌氧培养盒并不像厌氧工作站一样体积巨大，需要时常取放实验物品或者进行实验操作而出现 O2 进入的风险；反之，厌氧培养盒具有优秀的气密性，并且在整个厌氧培养实验中一直维持密封，整体组装也在厌氧工作站内进行，故无需除氧。

 实验中，厌氧培养盒内放置有氧气指示剂，当盒内气体氛围达到厌氧状态时，氧气指示剂会维持粉色(图 2)，表明此时厌氧培养盒内气体中O2 浓度低于检测下限(≤0.1%)。这种状态会在厌氧盒密封并持续通入厌氧混合气时长期维持，只有在实验中切换所通入的气体，将厌氧混合气换成压缩空气时，指示剂才会较快地变为蓝紫色(超过检测上限 0.5%)，表明厌氧培养盒内气体中的氧气浓度迅速提升至与空气相同。

图 2 培养 48 h 后厌氧培养装置内氧气指示剂

3.1.2 细胞水平

在细胞学水平，本实验采用荧光蛋白作为严格厌氧指示剂。荧光蛋白基因位于细菌染色体上，属于组成型表达基因，这意味着荧光蛋白在稳态生长的细菌细胞中始终处于动态平衡状态。而作为常规的荧光蛋白，其成熟发光除了特定光激发之外，还有一个基础条件就是氧气的存在，除非是特定改造专门适用于厌氧环境激发的荧光蛋白。

如图 3(d)所示，在有氧培养下，微流控芯片中细菌细胞表达的荧光蛋白受激发产生明显的荧光；而在厌氧培养下，虽然对明场延时拍摄图片的分析表明细菌细胞生长状态稳定(图 4(b)，左半部分)，但是细胞中的荧光蛋白在相应波长激发光激发下，并无明显的可见荧光产生(图 3(b)，LUTs 打开增强敏感度，故视野并非黑白)，说明此时细胞内氧气浓度不足以保证荧光蛋白成熟而受激发光。Hansen 等研究表明，1×10－7 浓度的溶解氧足以使荧光蛋白受激发产生荧光，而2.5×10－8 浓度的溶解氧则不足以支持荧光蛋白受激发而发光。本实验结果表明，在厌氧培养盒持续通入厌氧混合气进行厌氧培养时，微流控芯片内溶解氧浓度至少低于 1×10－7，达到了优秀的严格厌氧程度，完全满足兼性厌氧菌与严格厌氧菌的厌氧培养，实际上 0.1% 的氧气组成已不会对一些严格厌氧菌的正常生长产生影响。

图 3 大肠杆菌厌氧及有氧条件下明场相差及对应荧光场图像

图 4 芯片内细菌细胞在严格厌氧条件下稳定生长与分裂

3.2 细菌单细胞稳定生长

 在单细胞实验完成后，采用自主研发的分析程序进行图像分析与数据处理。通过对大量单细胞的生长速率进行分析可知(图 4)：对于严格厌氧菌(B. fragilis)，此实验方法可以保证其长期稳定地进行生长与分裂；对于兼性厌氧菌 (E. coli)，此实验方法既可以提供厌氧环境确保厌氧稳定生长，又可以将通入的厌氧混合气改为空气使其实现常氧生长。

4 结果与讨论

 当下对细菌生理学的研究越来越关注单细胞的细胞异质性，如细菌群体中基因回路的动态表达、细胞生理状态对抗生素的敏感性、对细菌耐药性产生过程中起重要作用的持留性细胞等。除了方兴未艾的微生物单细胞基因组和转录组研究外，往往仅采用传统的群体分批培养方法，而这在研究的时空“分辨率”上是远远不够的。基于微流控芯片的单细胞技术为研究细胞异质性提供了可能，这些方法中比较重要的一大类就是基于高分辨率显微镜的延时拍摄技术。对于在常氧条件下进行常规细菌培养，已经有许多相关培养方法，包括基于琼脂糖平板培养、基于微流控芯片培养等，其中后者能够在保证稳定生长分裂前提下，实现上百代细菌的单细胞谱系追踪，但对于厌氧条件下的单细菌长期培养的研究甚少。

 厌氧菌在自然界广泛存在，而且人体肠道本就是一种厌氧环境。现在普遍认为肠道微生物对人类的健康具有很大的影响，如疟疾、肥胖、糖尿病、癌症的免疫应答、神经(脑肠轴)等，甚至有望基于肠道微生物进行个性化医疗。基于此，在进行单细胞实验时，需要考虑到厌氧这一条件对细菌细胞生理的影响。针对以上需求，需要开发一种对培养环境氧气氛围有着严格控制的实验装置。无论是琼脂糖平板培养还是微流控芯片培养，在不需要控制氧气组成比例的前提下，所需实验空间都不大，可以便捷地与商业化显微镜标本夹相结合使用。但是，目前商业显微镜移动平台与细胞培养装置并不能营造厌氧环境，因为这需要额外提供具有优秀气密性的培养装置。这种装置需能够同时容纳单细胞培养微环境与液体培养基，在装置外还需要相应的气体调节与维持系统，最后为了方便实验数据的实时采集、提高数据可信度、降低实验复杂性、提高方法通用性，往往需要在设计时就考虑到培养装置与显微成像系统的合理适配。

 目前涉及到厌氧条件的细菌单细胞方法的相关报道并不多，尤其是能够直接与显微延时拍摄相结合的方法只有基于原有设计——在琼脂糖平板外添加密封装置并通入厌氧混合气，以此实现对一种厌氧的脱硫弧菌(Desulfovibrio Vulgaris Hildenborough)的培养。此外，借此研究了可逆的低浓度氧气暴露对细胞分裂的影响。此方法由于是固体平板培养，存在营养消耗的影响，难以完美地保持稳定生长，而且所采集的数据量较少、难以追踪单细胞谱系。虽如文中所述，培养时细菌细胞内荧光蛋白无法受激发发出荧光，以此论证其实验装置的厌氧程度，但是针对“无荧光”这一关键要素并未提供实验结果支持。而实际上有研究表明，培养气体氛围中 0.1% 的氧气就足以满足荧光蛋白受激发光所需，在此氧气浓度下即便是严格厌氧菌，由于其对氧气有一定的耐受性，也可正常生长，故仅有严格厌氧菌生长的实验结果并不能说明其实验装置厌氧程度很高。

 本文所描述的细菌单细胞实时观测系统主要创新之处在于使用了一种自主设计的厌氧培养装置。它是由 3D 打印和数控机床加工而来，内部承载微流控芯片和液体培养基，进行组装密封后，具有优异的气密性：氧气指示剂达到测量下限(0.1%)，而细菌内荧光蛋白受激发无明显可见亮光，进一步证明细胞培养基中溶解氧浓度低于1×10－7。该装置可以适配商业化显微镜的适配器，又与气体调节系统相连，后者为装置内部持续通入厌氧气体，在负压的驱动下，新鲜液体培养基持续不断地为细菌细胞提供营养，最终能够确保芯片内所培养的细菌细胞在长期稳定的严格厌氧环境下进行生长与分裂(前提是细菌本身能够在厌氧环境下生长)。本文所开发的实验装置及相应的整套实验流程为严格厌氧条件下的细菌生理学研究提供了有力的技术支持。同时，由于整个实验装置出色的气密性，除了严格厌氧微生物培养，还可以定量化探究不同气体组成对特定微生物生长的影响。但本实验系统目前只能使用单一培养基进行微生物培养，尚不能满足一些需要切换培养基的特殊实验需求，希望未来的研究能对此进行优化。

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