用于药物筛选的微流控细胞阵列芯片
摘要
细胞区域分布培养以及如何有效地对微流体进行操控是微流控阵列芯片在细胞药物研究中的关键技术。本研究介绍了一种利用SU-8负性光刻胶模具和PDMS制作双层结构的微流控细胞阵列芯片的方法,该芯片通过C型的坝结构将进样细胞拦截在芯片的细胞培养的固定区域,键合双层PDMS构成阀控制层,阀网络的开关作用成功实现了芯片通道内微流体的操控,同时芯片设计了药物浓度梯度网络,产生6个不同浓度的药物刺激细胞。通过对芯片3种共培养细胞活性的检测和药物伊立替康(CTP-11)对肝癌细胞的浓度梯度刺激等实验结果验证该芯片在细胞研究和药物筛选等方面的可行性。
对大量化合物进行快速、高通量筛选、低试剂消耗和低成本是药物筛选发展过程的研究目标。近几年来出现快速、高效的高通量筛选被广泛发展和应用，成为药物筛选的主要技术手段之一,但其自身存在一些局限,如多孔板(通常为96孔板)消耗的试剂量大、样品的分配和操作难度较大、设备昂贵等。而基于微加工技术的微流控芯片技术具有分析速度快、试剂消耗少、易于集成和高通量分析等诸多优点,可以克服高通量药物筛选的限制,为基于细胞的药物筛选、组织工程和生物传感器提供新的研究平台。
利用微流控技术,开发微流控阵列细胞芯片应用于高通量药物筛选具有很多独特的优势。微流控芯片这个微小平台可以集成256个或更多的细胞培养腔微阵列，改变常规细胞培养方法,实现细胞药物筛选的高通量化,而且芯片微纳升级体积大大减少了试剂消耗量,减低药物筛选成本;微流控芯片设计二维或者三维的微结构区域可产生低剪切力,使多种化合物进入、混合,形成浓度梯度,观察细胞对不同浓度药物的反应,从而进行药物对细胞的毒性分析；微流控芯片的集成化优势非常明显,在芯片内可以集成微阀、微泵和电极等器件，将药物的合成分离富集、实验细胞培养、药物效果检测等多个步骤集成到一块芯片,实现药物筛选的自动化分析。将微流控技术与细胞培养技术相结合,构建药物筛选的细胞微系统平台是目前的研究热点。
细胞在芯片的区域分布以及如何实现微流体的操控以及对细胞进行药物作用是微流控技术在细胞高通量药物筛选的研究应用的关键和难点。因此本研究介绍一种用于药物筛选的微流控细胞阵列芯片。采用微加工技术设计和制作该芯片,在芯片上制作独特的培养腔阵列及其微通道,进行细胞的固定分布和共培养,并在芯片上设计药物浓度梯度网络,当药物注入芯片时,得到不同浓度的药物成分作用细胞。微流体的控制通过微阀网络来实现,从而保证了培养腔不同细胞培养的相对独立,保持药物浓度梯度的稳定性。同时本研究进行了抗肿瘤药物伊立替康(CTP-11)对肝癌细胞的药物筛选实验,通过实验室自制的加热平台上实现对该芯片细胞活性和药物作用的实时观察和检测。
1实验部分
1.1 芯片的设计
本实验设计的微流控细胞阵列芯片如图1a所示,它有3层结构,上面一层是阀控制通道层,中间一层是流体通道层,下面一层是适合细胞贴壁的玻璃层(图1b所示)。流体层包括药物浓度梯度网络、6×6细胞培养腔阵列以及进出样管道。细胞培养腔阵列在纵横二维是连通的,纵向通道可以同时进样培养3种不同细胞,横向通道可以进样培养液和药物。流体层的通道高为50μm,宽为100μm,每个培养腔为600μm×600μm,中间有一个半径为200μm的C型坝结构,坝高45μm,宽50μm,该结构可以将细胞拦截在坝内,保证细胞在固定的区域生长,而培养基和药物等液体可以自由流通;药物梯度网络包含2个进样孔和5级浓度梯度通道,可产生6个不同浓度的药物溶液。阀控制通道层有2组控制阀:横向阀和纵向阀,通过阀的开关作用实现对下一层的细胞培养阵列横向通道和纵向通道的液流控制。
图 1 微流控细胞阵列芯片设计示意图
Fig. 1 Schematic illustration of microfluidic chip. (a) Schematic illustration of microfluidic chip. (b) Three layers of the microfluidic chip. (c) 3-D structure of a chamber containing row valves(yellow), column valves(blue) and C-shaped dam(red).
1.2 具有坝结构的三层微流控芯片的制作
该微流控芯片采用多次软光刻技术以及模塑法制作,具体工艺流程如图2所示。芯片制作的关键工艺是通过制作双层的SU-8负性光刻胶的流体层模具形成坝结构以及热键合法制作双层的PDMS(聚二甲基硅氧烷)芯片。首先是利用“多次曝光、一次显影”工艺制作SU-8胶双层的芯片模具。在清洗干净的硅片基底上甩涂稀释的SU8-2025用SU8-2025与环戊酮按体积比100:53稀释而成),厚约5μm,放在热板上65oC烘1min,然后升温至95oC保持2min,缓慢降温至室温,在光刻机上第1次曝光后,将硅片放到热板上进行PEB，即65oC加热烘1min,然后升温到95oC保持2min,之后缓慢降至室温,这样第一层的图形就转移到SU-8光刻胶上。再将SU8-2050甩涂到基片上,完成前烘,将第二层掩模板与第一层光刻图形对准,第二次曝光和后烘最后超声辅助显影就形成双层图形结构的SU-8模具。同理,完成单层的阀控制层SU-8模具的制作。
图 2 微流控芯片的制作工艺流程 Fig. 2 Fabrication process for microfluidic chip.
为制作双层的PDMS芯片,先将PDMS单体与固化剂按重量比20:1均匀混合,抽真空进行脱气处理后,倒入流体层SU-8模具,在甩胶台上转速800r/min甩涂30s,然后放置在热板上70oC加热10min,形成150μm厚的PDMS薄层;接着调配单体与固化剂比为10:1的PDMS,真空脱气处理后,浇注在阀控制层的SU-8模具中,厚为5mm,在热板70oC加热20min,冷却后从硅片剥离,将剥离的阀控制PDMS层在显微镜下与流体层的PDMS薄层对准贴合,然后移至热板上90oC加热1h,完成双层PDMS的热化学键合反应,最后将双层PDMS从硅片上剥离,打好孔并切割合适大小,与清洗干净的玻璃片进行氧等离子键合,形成芯片通道的封闭,完成微流控双层PDMS细胞阵列芯片的制作。
1.3 微流控芯片流体的操控
在芯片集成微阀以实现对芯片通道微流体的控制。微阀的结构是由上层阀控制层PDMS与下层流体层的PDMS薄膜构成。由于PDMS具有透气性,不适合采用空气阀,因此本实验芯片采用液压阀,即在阀通道内注入水或其他液体,通过注射器对阀通道的液体施加压力(图3b,P>0),下层的PDMS因杨氏模量小且厚度薄,易发生形变,阻挡下层的PDMS通道液体的流动,从而实现阀对通道的封闭效果;当压力移除后(图3a,P=0),PDMS薄膜恢复形变,恢复流体层通道的液体的流通。芯片的阀控制层有两组阀:横向阀和纵向阀。当多种细胞进样时,横向阀打开,纵向阀关闭,不同的细胞分别进入纵向的细胞培养腔,由于纵向阀阻隔了横向通道的液体流动,各个纵向的细胞不会进入别的纵向细胞培养腔,从而实现多种细胞共培养(图3c);当进行药物实验时,横向阀关闭,纵向阀打开,药物溶液可以保持稳定的浓度作用于横向的不同细胞的培养腔(图3d)。因此芯片两组阀的操控可以进行对芯片通道内的微流体的控制,实现了芯片多种细胞的共培养和不同浓度的药物分别对不同的细胞进行刺激的功能。
图 3 微阀的结构图和工作原理图 Fig. 3 Structure and work mechanism of the microvalve.
1.4 微芯片细胞的培养
微流控细胞阵列芯片培养的细胞采用人肝癌细胞SMMC-7721、人肝正常细胞HL-7702和人脐静脉内皮细胞HUVEC-2C。细胞培养液为RMPI1640，添加10%的胎牛血清和1%的链青双抗，细胞消化液为0.25%的胰酶和0.02%的EDTA。
用聚合物管将制作好的芯片与带有开关阀的注射器接连,接口处用粘接剂ELASTOSILE43密封。连接好的芯片通入75%乙醇,用紫外线照射1h,进行消毒处理。先用注射泵在芯片内通入细胞培养液2h,以排除芯片内残余的乙醇和气泡,有利于细胞在培养腔内贴壁生长。芯片移到实验室自制的ITO玻璃加热平台，用连接开关阀的注射器对芯片的纵向阀加压,然后将生长状态良好的细胞从常规细胞培养皿中消化,吹打均匀,通过注射泵导入芯片的各纵列细胞培养腔,进行细胞培养。每24h通过注射泵更换一次细胞培养液,注射泵流速为0.2μL/s,进样10min,以保证细胞培养时的营养更新和代谢物的排除。
1.5 微芯片细胞的药物作用与检测
芯片细胞培养72h后,关闭芯片的细胞进样口和纵向阀,横向阀加压,芯片药物梯度浓度网络的一个进样口注入含药物CTP-11的培养液,另一个进样口注入无药物的培养液,2个进样口的进样速率为0.2μL/s,进样10min。药物作用细胞24h后,用PBS除去药物溶液。
芯片内各个培养腔的细胞活性和药物对细胞的作用是通过LIVE/DEADViability/CytotoxicityKit荧光试剂盒进行检测。对芯片待检测的细胞,先通入PBS清洗,再通入含2μmol/LCalceinAM和4μmol/Lethidiumhomodier-1的荧光染料混合液在室温下孵育30min,然后在荧光显微镜下观察并拍照,拍照的图片用图像分析软件进行数据分析。
2结果与讨论
2.1芯片的制作
通过微加工技术制作微流控芯片的模具可以由硅片、玻璃和SU-8负光刻胶等材料制作。SU-8负光刻胶可以制作高深宽比的厚膜图形,以及它良好的力学性能和抗化学腐蚀性,而且它可以通过多次光刻形成台阶形多层结构复杂的图形,这是硅片和玻璃等材料不能与之媲美的,因此基于SU-8负光刻胶加工模具的技术在微尺寸的微流控领域得到了广泛应用。本实验的芯片模具采用“两次曝光,一次显影”的方法制作双层结构的SU-8模具,该方法简便易行、经济耐用。
本实验中通过双层PDMS与玻璃键合制作微流控细胞阵列芯片。PDMS是目前微流控技术中被广泛采用的一种材料,由于其具有很好的透气性,因此在PDMS芯片细胞生长时所需要的氧气完全可以通过PDMS的通透性获得,而不需要在培养液中溶解氧气,且PDMS具有良好的透光性和生物相容性,有利于芯片内细胞培养和实时观察。此外通过热化学反应,两层未完全固化的PDMS之间的界面发生交联,完成两层PDMS的键合,这种方法的粘合牢固,可以承受6×105帕以上的压力。双层PDMS构成控制阀,实现了对微流控芯片的流体的控制,增加了实验芯片的功能和操控性。最终制成的微流控细胞阵列芯片如图4所示,芯片只有一片普通载玻片的大小,芯片内通道的总体积约为5μL,在细胞药物实验中所需的培养液和药物的消耗为微升数量级,这大大降低了药物筛选的实验成本。
图 4 微流控细胞阵列芯片的实物图 Fig. 4 Photograph of the final microfluidic cell culture array chip.
2.2药物浓度梯度的表征
微流控芯片的药物浓度梯度的形成机制是基于微通道的层流的扩散混合效应。细胞阵列芯片的药物浓度梯度网络具有5级浓度梯度通道,细胞培养液和含一定药物浓度的细胞培养混合液通过注射泵和连接管以相同的流速分别从2个进样口注入,液流先分为2支相同浓度的分流,其中相邻的2支分流在通道中间混合、扩散,组合成新的浓度的液流进入下一级,在第二级通道网络构成3种不同浓度的液流分支。这样不同浓度的液流不断地分流、混合、扩散,形成新的浓度的液流,芯片最终产生6个浓度梯度的细胞培养混合液。浓度梯度通道采用半径为50μm的半圆波浪型通道,这样的结构可以加强微流控通道的层流效应,可以使药物浓度产生更好的混合效果。
实验采用与药物伊立替康分子量(677.19)相近的荧光染料罗丹明B代替药物进行芯片的药物浓度梯度的表征实验。将含有1mmol/L罗丹明B的细胞培养液和纯细胞培养液通过注射泵以0.2μL/min的相同流速从进样口同时进入芯片浓度梯度网络,2h后,浓度梯度网络形成稳定的梯度浓度罗丹明B溶液,用荧光显微镜拍照6个管道的荧光图片(图5),用图像分析软件ImageProPlus6.0分析每个通道的相对荧光值(虚线上通道平均荧光值减去背景平均荧光值),从而得到6个通道的罗丹明B浓度(0、0.212、0.523、0.668、0.769和1.0mmol/L)。从实验数据分析可知,芯片的药物浓度梯度网络可以产生6个具有一定线性的不同浓度药物溶液同时进入细胞培养腔,刺激细胞。
图 5 芯片的罗丹明 B 药物浓度梯度的表征 Fig. 5 Fluorescence micrograph showing six gradient concentrations of Rhodamine B.
2.3芯片细胞的进样与培养
细胞进样时在芯片内的分布是通过芯片培养腔的C型坝结构的物理拦截来实现的。坝顶部与玻璃层之间构成一个高度为5μm的狭缝,而细胞的直径一般为10~20μm,因此,细胞进入培养腔,由于狭缝的拦截作用和微流体的流动,细胞只分布在培养腔的中心区域,即C型坝内,而其他区域的细胞会随着流体流走,这样细胞阵列芯片可以有效地控制进样细胞的分布区域,以便观察和分析。图7a为细胞进样时在培养腔的分布,进样的细胞都被捕获在坝的缝隙了,当坝的缝隙布满了细胞后,细胞不再进入坝内,流向下一行的培养腔,这样每一行的细胞进样数目基本相同,这样有利于提高细胞分析的可比性和准确性。因此芯片的坝结构对细胞具有很好的拦截作用,而且可以很好地模拟组织细胞培养生长的微环境。
图 7 细胞在芯片培养腔的培养、药物作用与检测 Fig. 7 Culturing, drug screening and detection of cells in the chip. (a) Cells growth in the chip after 0 h and 48 h. (b, c, d) Live and dead cells cells stained with Calcein AM and EthD-1 with 24 h treatment of 0, 52.3,76.9 μm/mLCTP-11.
三种细胞(癌细胞SMMC7721、正常肝细胞HL-7702和人脐静脉内皮细胞HUVEC-2C)在芯片阀控制层的作用下分别进入不同列的细胞培养腔,待细胞贴壁后,除去阀作用,实现细胞的共培养。3种不同的细胞可以在物理上保持独立性,同时可以通过液体流动保持彼此的联系和相互作用,这样的细胞共培养可以简单实现一个生理组织(如肝癌组织)的体外模拟培养。图7通过对芯片各个培养腔细胞的荧光照片进行分析,在芯片内3种细胞的活性都可在95%以上,表明了该芯片内的细胞的生长状态良好,适宜进行相关的细胞研究。
2.4CTP-11对肝癌细胞的药物筛选
从芯片药物浓度梯度的表征实验可知,当通入浓度为100μg/mL的CTP-11溶液,芯片可形成6个一定梯度的药物浓度作用芯片培养的肝癌细胞(0、21.2、52.3、66.8、76.9和100μg/mL),细胞的活性分别为91.6%、84%、75.3%、66.1%、55.3%和37.4%(图6)。因此不同浓度CTP-11作用细胞后,细胞生长活性受到不同程度的抑制,抑制作用随药物浓度的升高而增强。通过对荧光照片的分析,在不同药物浓度作用下,可以发现凋亡过程中细胞的形态变化,如细胞体积缩小、细胞突起以及凋亡小体(图7c、7d)。可见本实验的微流控芯片通过一定的梯度浓度药物刺激细胞,分析细胞对不同浓度药物的毒性反应,研究药物作用的机理,实现细胞药物的筛选。
图 6 不同浓度的 CTP-11 对肝癌细胞的活性检测 Fig. 6 Viability of SMMC-7721 against six gradient concentrations of CTP-11 in the chip.
3结论
本研究通过对“多次曝光,一次显影”SU-8工艺以及多层PDMS键合工艺的研究,设计并制作了具有高深宽比的双层结构的SU-8光刻胶模具,制作了C型坝三维结构的细胞培养腔阵列,能够很好地控制细胞在芯片内的生长分布,有效地解决阵列芯片细胞分布无序的难题。通过双层PDMS键合将微阀器件集成到芯片上,通过对阀控制网络的操控实现阵列芯片流体的控制。这些工艺的研究有效地解决了微流控芯片在基于细胞研究方面的一些关键问题。芯片还设计了药物浓度梯度网络,形成稳定的梯度药物浓度,以便研究不同浓度药物对细胞的毒性作用。这些实验验证了微流控细胞阵列芯片在实现细胞药物筛选的高通量、低消耗低成本和快速高效等功能的可行性。因此,将微流控技术和细胞培养技术有机结合,可以实现多种细胞的固定培养和不同浓度药物对不同细胞进行并行刺激,为了药物筛选和细胞组织工程研究提供了一个理想的研究方法和平台。
文献来源：生物工程学报 作者：郑允焕 吴建璋 邵建波等（转载仅供参考学习及传递有用信息，版权归原作者所有，如侵犯权益，请联系删除）