如何制作一枚医学微芯片？

微流体设备有望简化遗传疾病的诊断

在Dino Di Carlo位于加州大学洛杉矶分校的实验室，生物工程师们一天中有许多时间都从头到脚包裹得严严实实，而且看起来脸色蜡黄。这些工程师在洁净室工作，在那里，经过过滤的稳定气流会去除空气中的颗粒物。蓝光或紫光会导致他们使用的光敏材料固化，所以只能使用奶黄色的灯光。

他们与该领域的其他科学家正在制造用于预处理和分析血液和其他流体样本，以诊断基因突变（比如癌细胞携带的突变）的工具。此类工具一般不需要用到洁净室，但Di Carlo实验室开发的工具依赖于流体沿管道流动的能力，这些管道小到可能会被一颗灰尘堵住：这一领域被称作微流体技术。理论上，这些在载玻片大小的芯片上开展的分析应该是快速而自动化的：输入样品，读出结果，简单得连新手都可以使用。但在实际中，这些设备很少能做到全自动运行，通常都需要一些样品预处理过程。

包括Di Carlo在内的科研人员正在着手解决这些缺点，试验各种材料和设计，好让芯片更易制作。他们面临的挑战包括预测狭小空间内的流体行为，以及制作出高效廉价的芯片等。日本冲绳科学技术大学院大学的化学工程师Amy Shen指出，解决这些问题需要多学科合作。带来的回报则包括节省实验室时间和经费、开发加速遗传病和传染病诊断的医疗仪器等等。

通过微流体系统，科学家得以对珍贵或数量有限的样品加以利用，在使用昂贵试剂时获得更多的结果。对体积微小的液体进行操作使得快速并行分析成为了可能。由于只有机器才能操纵这么微小的体积，微流体系统也有利于自动化实验流程，从而减少了人为操作失误。理想情况下，就连只受过极少训练的技术人员也能开展试验。

这一目标仍然难以实现。目前，开发人员重点关注的是将分析血液和其他体液中DNA或RNA的过程微型化，比如开发微小版的聚合酶链式反应（PCR）仪来复制和量化稀有的基因序列，或通过杂交来连接核酸与荧光探针。其结果是，微芯片方法往往需要使用已经经过处理的生物材料：举例来说，需要先去除会干扰反应的组分。位于法国巴黎的基础科学研究机构，法国国家科学研究中心（CNRS）的研究主管Jean-Louis Viovy表示，主要瓶颈在于“试图扩大微流体领域的工具箱，从而把从实际样本到获得结果过程中的各个步骤都集成在微流体系统中。” Viovy也是巴黎附近的微流体公司Fluigent的技术创始人。

清除疾病

Di Carlo的实验室为一种特殊的样本处理过程开发了方法：分离循环肿瘤细胞（CTCs）。CTCs是一种血液肿瘤标志物，能揭示出肿瘤起源和引起肿瘤的突变。实验室使用了常用的光刻技术，以透明硅橡胶材料PDMS为原材料制作芯片。在洁净室，工程师将光刻胶铺在圆形硅片（即制作计算机微芯片的材料）上。 然后，工程师模仿半导体业的流程，将打印出来的黑色“光掩模”（上有芯片所需的管道形状，管道部分透光）覆盖在光刻胶上，再将其在紫外光下曝光，使透光部分的光刻胶固化，从而产生与芯片管道结构相反的模具。

然后，Di Carlo的工程师回到普通实验室，为了制作芯片，他们将液态的PDMS倒在先前做好的具有管道结构的硅片上，并在65摄氏度下烘干，以固化PDMS。 最后，他们将一个载玻片与PDMS的底部粘合在一起，就制成了一个原型芯片；它看起来和摸起来都像是一种特别结实的透明胶状物。整个过程大概需要一天。

Di Carlo说，一旦他们选定了一种能够满足他们目标的设计，他们就会订制塑料版本的芯片。塑料芯片的制作过程与塑料玩具一样。

大多数芯片制作技术产出的都是二维结构，但三维结构有时也很有价值。在Di Carlo正在设计的一种芯片中，他使用磁场将液体从一个狭窄的管道拉到一个更高、更宽的管道。随着液体开始在较大的腔体中铺展，表面张力会使它形成球体，进而变成液滴。Di Carlo说：“它基本上是一种纳升级的移液器，这种操作是人手工无法实现的。” 芯片能通过这种分割方法将血液等流体分成多个离散的反应小室，从而同时进行多个实验。

Box1：芯片设计技巧

微流体涡旋芯片中形成的层流微旋涡上的微珠轨道。

制作微流控芯片的过程一般始于用AutoCAD, Adobe Illustrator或SolidWorks等软件绘图。加州大学洛杉矶分校的生物工程师Dino Di Carlo说：“我们可以画出管道的路径。”

他说，微管道中的流体流动是可以预测的。但是，处理数据需要用到超级计算机。尽管软件有所帮助，大多数研究人员还是更愿意反复制作芯片，直到获得他们想要的流动为止。Fluigent微流体公司的技术创始人Jean-Louis Viovy表示，Fluigent公司提供的软件工具能帮助科研人员改进芯片设计。

Di Carlo课题组开发了他们自己的仿真软件 ，名叫uFlow。他们认识到，微流控芯片经常包含重复的结构元素，例如分开液流的S形曲线或微柱，他们用超级计算机计算了每一个元素，以弄清它们如何改变流动。uFlow使用了这些数据，将每个元素的终点作为下一个的起点，从而在模拟复杂管道形状时节约处理能力。

一旦得到了想要的芯片设计，科研人员便可以从几种获得芯片的方法中做出选择。他们可以自己设计制作，也可以订购定制芯片。就职于麻省总医院的研究者 Shannon Stott和她的同事向日本电子巨头索尼公司的一个分部（目前由德国Stratec公司所有）外包了制作过程，用索尼制作蓝光光盘的机器来制作血液分选芯片。

还有一些标准微流控芯片可用于实现常用功能。供应商有很多：比较主流的选择包括位于美国加州圣克拉拉的安捷伦科技公司； 位于英国罗伊斯顿的Dolomite公司；位于加州南旧金山的Fluidigm公司和前文所述的Fluigent公司。 

要制作三维芯片，科学家们通常需要将聚合物层层堆叠在光刻模具中。然而，一种入门级芯片制作方法的设计者表示，3D打印正在改变这一状况，因为它不需要太多专业知识或设备。荷兰瓦赫宁根大学的化学家Vittorio Saggiomo在家中偶然萌生了这个想法。他 会3D打印塑料工具（比如小灯或者移液器支架）和有趣的东西（比如鸟窝）。有一天，他把一个3D打印的《星球大战》头盔浸入了丙酮溶液中，好让头盔表面更加光滑，但他放的时间太长，整个头盔都被溶解了。他意识到，同样的方法也可以用来塑造微管道。

Saggiomo和他同为化学家的同事Aldrik Velders将这个过程应用在了实验室里。他们使用3D打印机制作出想要的管道形状，让塑料结构悬浮在PDMS。待固化后，再将其在丙酮中浸泡过夜以溶解塑料，最终得到立等可取的微芯片。Saggiomo和Velders正在使用这种方法制作螺旋管和交织的管道。其他方法很难制作这类结构：举例来说，他们设计的一种芯片拥有一根被螺旋管道缠绕的直管道。Saggiomo说，使用者可以在螺旋管道里通热液或冷液，从而在PCR等技术中改变样品的温度。即使在标准制造流程中，芯片设计师也能使用诸如V型、角和蜿蜒曲线等管道设计来发挥创意。Di Carlo说，虽然这一领域已经开始了标准化设计的开发，但在设计多样的流体通路方面仍有许多发挥的空间。

芯片设计师也在努力预测这一量级上的流体动力学。Elvesys创新中心（位于巴黎的一个微流体公司）的工程师Walter Minnella表示：“这个尺度下，（流体）的物理机制与浴缸里的水完全不同。”一些力，比如重力，变得可以忽略不计，而高表面积/体积比会产生表面张力，并对流体和管道壁面之间的相互作用产生极大的影响。Di Carlo说，水溶液会变得粘稠，就像蜂蜜，但没有湍流。 因此，流体运动是可以预测的——但他估计可能仍然需要超级计算机算上一两天才能解决，这就导致反复模拟变得不那么现实。大多数科学家选择了经验方法：构建，测试，再重复（参见“芯片设计技巧”）。

血液中细胞的分离

在定下目前的芯片设计前，麻省总医院的机械工程师Shannon Stott和她的课题组制作了多个版本的芯片。他们研究的是液体活检，一种根据血液中的遗传线索检测和诊断疾病的方法。他们的目标是开发一个可以从微创采集的血液样本中分离和分析CTCs的系统。他们将芯片命名为CTC-iChip — 'i'代表“惯性聚焦”（inertial focusing'），研究者利用这种技术将细胞排成一行，从而把CTCs与其他血细胞分开（参见“芯片结构解析”部分）。除此之外，团队还能利用这种芯片计数患者血液样本中的CTCs，并研究其遗传组成。

CTC-iChip由塑料制成，将三个阶段整合到了一块芯片中。在第一阶段，芯片会去除掉不需要的血液成分。科学家用磁珠标记白细胞，然后让液体流过配有一系列塑料微柱的腔室。红细胞和蛋白质等尺寸较小的成分能穿过这些微柱，就像蛾子飞过茂密的森林一样，而大一些的细胞，比如白细胞和稀有的CTCs则更像笨拙的大熊。它们被微柱弹离后，个大的细胞会沿着漏斗状流道进入第二阶段，即S型曲线流道，Stott将它们称为“摇摆器”，其作用是将细胞排成一行。在第三阶段，芯片用磁铁吸引连接了磁珠的白细胞离开流线，从而留下CTCs。

Di Carlo的实验室则开发了自己的微流体方法，以分类血样成分。他们使用了配有一系列侧室的管道，形状如同教堂外部的十字形侧翼走廊。他之前的学生SJ Claire Hur（现在是约翰·霍普金斯大学的机械工程师）注意到，较大的细胞会被捕获在微流体通道拓宽形成的旋涡中，就像树叶和垃圾围绕河流拐弯处或河流中的岩石聚积一样。他的团队设计了一个系统，利用这一原理分离CTCs用于后续分析，该系统现在已由加州门洛帕克市的Vortex Biosciences公司批量生产。研究人员正在临床研究中使用Vortex公司的产品，以识别CTCs中的标记物。这些标记物或许能揭示出肿瘤对特异性免疫疗法的响应程度。

Vortex的微芯片本身只有手掌大小，但整个系统还包括用于加入样品的外部管道和泵，以及回收收集到的CTCs的组分收集器。整个设备比微波炉稍大一点，不太像许多科学家所希望的一体化“芯片实验室”，而更像一个“实验室中的芯片”。

Di Carlo表示，这种“实验室中的芯片” 通常就已经够用了，它们仍然比常规方法更节约经费，还能尽可能减少实验者的人为误差，从而改进结果。 但是，一个真正的芯片实验室设备将有能力在发展中国家的诊所或野外工作站开展快速基因检测。在这些地区，购买和使用PCR仪或离心机来分离血样可能是不现实的。

真正的芯片实验室还在路上

工程师已经想出了一系列可能的解决方案。举例来说，一些人正在开发廉价的纸芯片，用于扩增和检测血样中传染性微生物的基因。德国内恩的Hain Lifescience公司设计了可以检测特定DNA序列的测试条。一种芯片可以通过搜索APOE基因突变来确定一个人患阿尔茨海默病的风险，另一种则能报告与强直性脊柱炎（一种侵犯脊柱的关节炎）相关的基因。

密歇根州立大学的环境工程师Syed Hashsham正在开发一种基于芯片的设备，以应用于癌症和传染病领域的基因诊断。他表示：“我们必须简化一切。”为了降低产品成本，并且让野外科学家也能密封芯片，他放弃了在野外条件下难以封装的硅基芯片，而选用了使用激光切割、薄膜封装的塑料芯片。另一个挑战是如何在野外现场环境中扩增出稀少的遗传物质，以达到能够检出的量。标准方法，也就是PCR，需要反复加热和冷却样品到精确的温度。但设计出一种便携、便宜、能够在不同温度间切换的小型设备并非易事，Hashsham说：“在野外，热循环是行不通的。”

在他的手持式微流体设备“Gene-Z”中，他采用了另一种核酸扩增技术来识别和定量已知的基因序列，比如指示癌症的小分子核糖核酸（miRNA），或者传染性有机体的基因。该技术被称为环介导等温扩增（LAMP）技术，使用的是与PCR反应不同的酶，而且不需要温度循环。研究人员将体液样本（如唾液）与荧光染料混合，荧光染料会与反应中产生的任意DNA结合，然后用注射器将混合物推入管道，管道连接着16个预先加入DNA扩增试剂、并晾干备好的独立储液池。反应完成后，该设备会通过使用发光二极管和传感器来检测荧光，以指示阳性反应。

Hashsham说，整个设备可由iPod Touch控制，而且制作成本不超过200美元。每个一次性芯片包括64个储液池，总共可以测试四个样品，成本低于一美元。他已经验证了Gene-Z对100多种疾病的检测结果。他表示，现在的挑战在于说服投资人出资生产无法马上获利的设备，因为他希望将这一设备应用能通过快速诊断改变医疗过程、挽救生命的地区，比如非洲。

将科研想法转化到商业世界确实很难——Shen也同意这种观点。她还指出，公司或许不会投资太过昂贵，或者无法用现有的流水线生产的设计。这意味着，微流体系统距离芯片实验室的理念还有很长的路要走。她说：“差距仍然存在，但我认为我们正在慢慢缩小这一差距。我们终将实现真正意义上的芯片实验室。”?

Nature|doi:10.1038/545511a

文献来源：发布在2017年5月24日的《自然》科技专题上 原文作者：Amber Dance（转载仅供参考学习及传递有用信息，版权归原作者所有，如侵犯权益，请联系删除）